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CRISPR下一代基因编辑工具开发（合成生物学方向）

1.1基因编辑技术发展简史

1.1.1从ZFN、TALEN到CRISPR的跨越

基因编辑技术的现代发展始于锌指核酸酶（ZFN）技术的出现。ZFN由锌指蛋白结构域与FokI核酸内切酶切割结构域融合而成，其中锌指蛋白可识别特定DNA三联碱基序列，而FokI二聚化后行使切割功能。理论上，通过组合不同的锌指模块，可实现对特定基因位点的靶向编辑。2005年，科学家首次利用ZFN成功在人类细胞中实现了基因敲除，标志着programmablenuclease时代的开启。然而，ZFN存在明显的局限性。其设计依赖于大量锌指模块的筛选与验证，且识别效率受上下游序列影响显著，导致脱靶率较高。此外，ZFN的组装过程复杂，成本高昂，极大地限制了其广泛应用。

为克服ZFN的不足，转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）技术应运而生。TALEN利用来自植物病原菌的TALE蛋白作为DNA识别模块，每个TALE重复单元可识别一个特定碱基，其识别密码简单明确（如NI识别A，NG识别T，HD识别C，NN识别G），与FokI切割结构域融合后实现DNA切割。相比ZFN，TALEN的设计更为灵活直观，靶点选择范围更广，且脱靶效应有所降低。2011年，多项研究证实TALEN可在多种细胞类型中实现高效基因编辑，尤其在模式动物构建和基因治疗领域展现出巨大潜力。但TA