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基因工程目的基因的制备;6学时

教学重点：基因组文库、cDNA文库及筛选文库方法的原理及操作规程。

第一节目的基因的制备

第二节目的基因的分离;第一节目的基因的制备

一、直接分离法

1、限制性核酸内切酶酶切分离法

已知序列基因.

酶切后分离

与适当载体重组

转入受体。;;2、物理化学法

密度梯度离心法：不同大小的DNA被分开，再用探针杂交检验。

单链酶解法：GC间三键，AT间双键，适当温度解开AT多的链，GC多的链未解开，用单链酶降解单链，剩下GC链。

分子杂交法：利用探针分子通过分子杂交固定相关基因。

是基因在发展初期所用的方法

;3、双抗体免疫法

蛋白质已分离纯化，并制备了它的抗体1。

mRNA合成蛋白质时与核糖体蛋白质结合形成聚合体。

分离这种蛋白质聚合体，与制备好的抗体1进行免疫反应。再加入抗体1的抗体进行免疫反应。

分离这种反应产物，再去除蛋白质，剩下mRNA，反转录后合成cDNA。;;去蛋白提取RNA，反转录合成cDNA;二构建基因组文库;1、基因文库的概念;2、基因文库的大小;;3、构建λ噬菌体基因组文库的步骤;切割方法：

物理学方法：机械力和超声波。

生物化学法：酶切

为满足切割的随机性，一般采用识别序列为4bp的限制酶。

如Sau3AI或MboI等切后的片段可直接与BamHI酶切的载体连接。

切割后通过凝胶电泳或密度梯度离心，回收一定大小范围的