微专题三　基因工程及其应用.pptxVIP

微专题三基因工程及其应用;课堂·重难突破;课堂·重难突破;2.选择限制酶时要考虑目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点及是否破坏目的基因和标记基因,从而确定限制酶的种类。限制酶切割载体的切割位点并不是任意的,切点所处位置必须在所需要的载体基因片段之外,避免载体因目的基因的插入而失活或影响鉴定和筛选。必须保证载体上至少有一个完整的标记基因,以便于检测。;(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类

①不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶,如上图不能选择SmaⅠ。

②应选择切割位点位于目的基因

两端的限制酶,如上图可选择PstⅠ

或PstⅠ和EcoRⅠ。

③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接,应使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如上图选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶,但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点,且切割位点不在标记基因内部。;(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类

①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致,以确保具有相同的末端。

②质粒作为载体必须具备标记基因,因此所选择的限制酶不能破坏质粒上的所有标记基因,即至少要保留一个标记基因,用于重组DNA的鉴定和筛选,如上图中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因,不能选用。;3.E.coliDNA连接酶与T4DNA连接酶都能将双链DNA片段“缝合”起来,恢复被限制酶切开的磷酸二酯键,但E.col