质粒的线性化及其用途.docxVIP

??PCR是扩增DNA的一项技术，在设计好引物后可以实现线性DNA的指数式扩增。那么环形质粒能否进行PCR，如何设计引物，扩增的产物是什么？

??如果是线性DNA的话，引物一般是依据模板DNA两端的序列进行设计，延伸到模板的末端即停止。质粒是环形双链没有末端，每条链均需要引物，引物需要2种。由于没有末端理论上来说引物结合在模板链的任何一个位置均可以，延伸至该引物的5’端停止，由于PCR体系无DNA连接酶，因此最后一个脱氧核苷酸无法和引物的5’端磷酸形成磷酸二酯键成环，因此质粒如果做PCR只能得到线性DNA。

??如何实现质粒线性化

??由于两条链的引物位置设计不同，可能导致环形质粒的扩增产物有2种，一是松散环形DNA（也可以说带有黏性末端DNA），二是线性DNA。

??1、产物是线性DNA

??若要想得到环形DNA，两个引物的5’末端相对“接在一起”中间不能再有碱基，这样能够得到末端平齐完全线性化的双链DNA。如上图所示。

??2、产物是具有粘性末端（3’突出）的线性DNA

??如果两个引物的5’末端之间有碱基的话，会得到具有粘性末端的线性DNA，如下图。不过由于末端互补，可以靠碱基互补配对黏合在一起形成环形。（可以联想目的基因如果用同一种限制酶酶切的话可能造成目的基因环化），不过如果没有DNA连接酶的话，这个环形质粒是有切口的，属于松散环形DNA，其本质还是