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基因工程的基本操作程序

一、目的基因的筛选与获取

利用PCR（聚合酶链式反应）获取和扩增目的基因

1.模板、引物

2.①稳定pH值保证酶的活性；②维持适宜的pH从而保持模板和引物稳定；③缓冲液中

Mg2+能激活DNA聚合酶等

3.使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸

4.引物2和引物3；5’

5.XmaⅠ、BclⅠ；引物2和引物3

6.引物1、引物3

7.琼脂糖凝胶电泳；紫外灯

8.复性温度太高；引物自连或互连

二、基因表达载体的构建

1.目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点

2.RNA聚合酶

3.终止子

4.限制酶、DNA连接酶

5.逆转录；不含有

6.B；确保融合基因转录出的mRNA能连续翻译，获得融合蛋白

7.X细胞特异性表达启动子

8.防止目的基因和质粒自身环化和反向连接

9.EcoRⅤ、SpeⅠ

10.NotⅠ、SacⅠ；3

11.BglⅡ、NheⅠ；CD

三、将目的基因导入受体细胞

花粉管通道法；农杆菌转化法；Ti质粒的T-DNA

显微注射法

2+

Ca/（CaCl）处理；使细胞处于一种能够吸收周围环境中DNA分子的生理状