2027届高中生物一轮复习大单元10生物技术与工程第48讲DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定课件.pptVIP

(3)引物修饰①引物的5′端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，5′端可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点(限制酶的识别序列，便于目的基因连接到载体上，两种引物则两种限制酶，以利于后期双酶切)；加荧光标记；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。②引物的延伸是从3′端开始的，3′端不能进行任何修饰。(4)退火温度要适宜退火温度高，扩增特异性强；退火温度低，扩增效率高。原因：如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当降低退火温度，使DNA双链结合。一对引物的退火温度相差4～6℃不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的。2．PCR的特殊应用(1)应用1：反向PCR测定未知DNA区域当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。原理：用限制性内切核酸酶切割该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。(2)应用2：PCR定点突变技术该技术要使用四种引物(见下图)。其中引物R1和F2的突起处代表与模板链不能互补的突变位