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实时荧光定量PCR（qPCR）实验结果完整分析

适用：基因相对表达量（2?ΔΔCt法，最常用）、绝对定量、熔解曲线分析；包含指标解读、合格判定、数据分析步骤、常见问题与原因。

一、核心基础概念

Ct值（循环阈值）

荧光信号首次超过阈值线时的循环数。

Ct越小：模板起始浓度越高，基因拷贝数多；

Ct越大：模板量低；Ct＞35一般认为无特异性扩增或信号微弱，谨慎使用；

阴性对照NTC理想状态：无扩增曲线、无Ct；若出现Ct，说明污染。

扩增曲线

合格曲线形态：基线平稳→指数上升期→平台期，S型光滑曲线。

熔解曲线（Tm曲线）

单尖锐峰：产物单一，特异性好；

出现杂峰、双峰、宽峰：存在非特异性扩增/引物二聚体。

内参基因（Referencegene）

常用GAPDH、β?actin、18SrRNA，用来校正RNA提取量、反转录效率、上样误差。

内参Ct建议控制在18～28之间，波动不能过大。

二、两种定量方式解读

方式1：相对定量（2?ΔΔCt法，科研最常用）

目的：比较各组基因表达倍数变化，不需要标准曲线。

计算公式

1）ΔCt=目的基因Ct?内参基因Ct（校正样本差异）

2）ΔΔCt=处理组ΔCt?对照组ΔCt

3）相对表达量=2?ΔΔCt

?结果解读：

2?ΔΔCt＞1：基因上调（表达升高）

2?ΔΔCt＝1：