第六章基因操作中大分子的分离和分析.pptVIP

第六章基因操作中大分子的分离和分析;分离核酸应注意以下几点:;1.1DNA提取得步骤

一、细胞破碎

二、除去与核酸结合得蛋白质等杂质

三、除去其她杂质核酸

四、获得DNA样品;一、细胞破碎

目前细胞破碎主要有物理破碎(主要就是机械破碎)和非物理破碎(主要化学破碎和生物酶解)

;(一)、物理破碎

目前常用物理破碎得方法主要有:均质珠子研磨振荡、液氮研磨、乳钵研磨、冻融、煮沸、超声波(ultrasonication)和微波加热(microwaveheating)等。

1.微波加热对于革兰氏阳性细菌非常有效,但就是加热必须适中,否则DNA可能被破坏。;2.热激处理包含冷冻和融解两步,冷冻主要就是用液氮、冰箱(?70℃、－20℃)或冰,而融解主要就是37℃、50℃、65℃或100℃水浴,其中冻融循环次数和孵育时间可以根据不同要求变化。

如,Lee(1996)等通过用吖啶橙染色直接统计经三次热激(?70℃/65℃)联合溶菌酶和SDS处理后得细胞裂解率为90%。

热激处理比其她物理处理得剪切力要小很多,而且提取效率、得到片段完整性较好。;3.珠子打击法(beadbeating)

加入不同直径得玻璃珠,有利于不同细胞DNA得提取:

①直径为710～1180μm玻璃珠可打碎土壤块和植物细胞;

②425～600μm玻璃珠可打碎真