一种白细胞介素2基因变构体的高效表达与纯化工艺.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，２９（１）：５６～６０ 一种白细胞介素２基因变构体的高效表达与纯化工艺 １ ２ ２ ２ 刘明军 　王　斌 　宋旭霞 　钱冬萌 （１青岛大学医学院附属医院　青岛　２６６００３　２青岛大学医学院医药生物技术重点实验室　青岛　２６６０２１） 摘要　利用定点诱变技术构建表达质粒ｐＥＴ１５ｂＭｈＩＬ２并将其在大肠杆菌中进行表达发酵的优 化研究，高效表达出可溶性的ＭｈＩＬ２重组蛋白。蛋白经过亲和层析、Ｔｈｒｏｍｂｉｎ酶切、离子交换层 析和凝胶过滤层析纯化，ＭｈＩＬ２纯度达９５％，且ＭｈＩＬ２比ｈＩＬ２具有更强的促进Ｔ细胞增殖生物 活性。 关键词　白细胞介素２　基因变构体　表达　纯化 中图分类号　Ｑ７８６ 　　白细胞介素２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ２，ＩＬ２）由活化的Ｔ细胞 ，下游引物（Ｐ２）５′ＣＡＣ ＡＣＡＡＴＧＴＡＣＡＧＧＡＴＧＣＡＡＣＴ３′ ［１～３］ ＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＧＴＴＡＧＴＧＴＴＧＡＧＡＴＧＡＴＧ３′，（Ｐ４）５′ 分泌，具有免疫调节等多种生物学活性 。其制剂已 用于肿瘤、免疫缺陷和感染性疾病的临床治疗并取得 ＴＡＡＴＴＡＴＣＡＡＧＴＴＡＧＴＧＴＴＧＡ３′，含突变位点的引物 ［３］ （Ｐ５）５′ＧＡＣＴＴＡＡＴＣＡＧＣＣＧＴＡＴＣＡＡＣＧＴＡＡＴＡ３′，（Ｐ６） 了显著的效果 。但重组 ＩＬ２制剂在临床使用过程 中，显示出抗肿瘤的活性不够特异、并可导致因自然杀 ５′ＴＡＴＴＡＣＧＴＴＧＡＴＡＣＧＧＣＴＧＡＴＴＡＡＧＴＣ３′由上海生工 伤（ｎａｔｕｒａｌｋｉｌｌｅｒ，ＮＫ）细胞过度活化产生的全身毒性等 公司合成。限制性核酸内切酶ＮｄｅＩ和ＢａｍＨＩ购自 ［４］ ＴａＫａＲａ公司。凝血酶Ｔｈｒｏｍｂｉｎ购自Ｓｉｇｍａ公司。兔抗 问题 。通过定点诱变技术产生的人白细胞介素２ （ｈｕｍａｎｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ２，ｈＩＬ２）的基因变构体（ｍｕｔａｎｔｏｆ 人ＩＬ２单克隆抗体购自美国ＣＨＥＭＩＣＯＮｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ公 ［４，５］ 司；羊抗兔 ＩｇＧ购自美国ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ公 ｈＩＬ２，ＭｈＩＬ２），能增强抗肿瘤活性，降低毒性 。 ＴＭ ２＋ 　　我们采用定点诱变技术成功地诱变 ＩＬ２编码基 司。ＨｉＴｒａｐ Ｎｉ螯合柱、ＭｏｎｏＳＧＬ柱、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５柱、 ＴＭ ＴＭ 因，使其第８８位氨基酸由天门冬酰胺（Ａｓｎ）变构为精 ＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ脱盐柱及?ＫＴＡ ＦＰＬＣ快速蛋白纯化 ［６］ 系统为ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ公司产品。重组人ＩＬ２标 氨酸（Ａｒｇ），并获得了变构的ＭｈＩＬ２基因克隆 。在 此基础上通过在大肠杆菌中高效表达和纯化研究，得 准品购自中国药品生物制品检定所。 到了高纯度的ＭｈＩＬ２，其在体外能促进Ｔ细胞的增值， １．２．１　表达质粒的构建　以已构建的ＩＬ２编码基因 ［６］ 具有比ｈＩＬ２更好的生物活性，为其在体内的生物学活 为扩增模板 ，使用引物Ｐ３、Ｐ４、含突变位点的引物Ｐ５ 性研究、大规模制备的中试放大研究奠定了基础。