[分子数量遗传学课件]用Bubble_PCR法对一个新的锌指基因进行外显子划界.pdfVIP

维普资讯 张民等：用BubblePCR法对一个新的锌指基因进行外显子划界 一 ； ’／ 、 ； {，／ ／ 用BubblePCR法对一个新的锌指基因进行外显子划界① ／I／ i#gs年7月lO日收到) 疗，7㈤ ~～~zoo。 摘 要 介绍7一种确定基因外显子一内含子交界点的快速、准确的方法，应用该方法对本室 ， 克隆的一个新的锌指基因ZNF191进行了外显子划界。将含有ZNF191全长cDNA的基 一 七， 固组DNA经限制酶酶切后与退火的Bubblelinker连接，以该连接产物为模板，用依据 cDNA序列设计的{l物和Bubblelinker上的特异引物进行PCR扩增，继以相同的扩增 条件砷扩增产物进行测序，从而确定7外显子一内舍子的交界点。结果确认出ZNF191基 因由4个外显子和3个内含子组成，这一结论为后来完成的ZNF191基因的全Jg~l序结 关键词：BubblePCR,[垦±墼 ，壁韭基旦ZNF191 十 叁 ～ ，『之 一 、 引 言 一 ① B63计划和国家自然科学基童资助项目 维普资讯 高技术通讯 1997．11 因ZNF191：的外显子划界为例，简要介绍这一简捷的方法 二、材料和方法 1．ZNF191全长cDNA 锌指基因ZNF191eDNA全长2513bp为本实验室克隆“、。 2．BubblePCR外显子划界的引物 根据eDNA序列中起始密码子 (ATG)和终止密码子 (TAA)的位置，设计引物A，B及C (图1、图5)，根据初步划界结果，再设计产物D、E及F(图1、图5)。参考文献Ez]设计Bubble 接头 (图2(a))，其中，按Bubble接头的上链有 “ANT”粘端而分为HinfI(识别位点为 “GANTC”)Bubble上链，无 “ANT”粘端则为RsaIBubble上链 两种bubble的上链除有无 “ANT”粘端之外，其余全部相同。BubblePCR的AP(arbitraryprimer)引物则设计于上链的错 配区。 OGGGG AACGGCGTTTCTGCGTCTGCCGTGGACAGCGAA 50 GTCTGCGGTTCCTGAGCCGGAGTTTGCGCCGGAGTGCCTGTGAAGAAA 100 GGGGTATTGCCCTGAGGCTTATATTCTGCCTCAGTTGTCTTTTCTTGAAA 150 rrATTATAAATcAGA!TGTcTGcAcAGTcAGTGGAAGAAGATTcAATAcTT 200 ATCATCCCAACTCCAGA · ·· ·· ·GGCAGTGACAGTGCTGGAGGA 550 TTTGGAGAGTGAACTTGATGACCCTGGACAACcGGTTTCTCTCCGTCGAC 600 GAAAACGGGAAGTACTAGTAGAAGACATGGTATCTCAAGAAGAAGCTCAG 650 GGATTACCAAGTTCTGAGCTTGATGCTGTGGAGAACCAGCTCAAGTGGGC 700 ATCCTGGGAGCTCCATTCCCTAAGGCACTGTGA