分子生物学实验指南.docVIP

目 录 实验前注意事项…………………………………………………………………………………1质粒DNA的小量制备……………………………………………………… ……………………2质粒DNA的凝胶电泳和纯化回收………………………………………… ……………………3感受态细菌的制备…………………………………………………………… …………………4基因克隆与亚克隆…………………………………………………………… …………………5蛋白定量…………………………………………………………… ……………………………8荧光素酶报告基因检测………………………………………… …………… …………………9聚合酶链反应技术…………………………………………………………… …………………11常规ELASE…………………………………………………………… …………………………15 GST－融合蛋白的表达与纯化………………………………………………… …… …………16 His－融合蛋白的表达与纯…………………………………………… …… ……………… … 17 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量……………………… ……………………18总RNA制备…………………………………………………………… ………………………20重组腺病毒载体的构建和制备…………………… …………………………… … …………24 蛋白离体结合实验……………………………………………………… …… …………………26 MAPK激酶检测方法……………………………………………………… … …………………27 蛋白质的化学发光免疫检测………………………… ………………………… ………………32 DNA测序…………………………………………………………… ……………………………37 脂质体介导瞬时转染真核细胞…………………… …… …………… …… ………… ………39 T7 Select phage display system…………… … ……………………………… …………………41 实验前注意事项 ????????? 移液器的使用 移液器是一种精密的分子生物学必备仪器，以Eppendorf的Research系列移液器为例，常用的有三种型号：0.5-10(L，20-200(L，100-1000(L。为了方便和精确起见，吸取液体要用配套的移液器。移液器内部的构成非常精密，注意不要随便打开，操作时动作要轻柔。 在进行移液操作时注意：不同的液体要用不同的枪头；要及时更换避免污染；吸取或打出液体时不要过分用力。 ????????? 在进行分子生物学实验时常用的离心管有0.2ml，1.5ml，1.5ml，2ml，15ml，50ml等型号，一般来说较小的型号用于核酸操作，较大的型号用于细胞方面的操作。在使用离心管时要注意：任何时候手都不要碰离心管的管盖内壁，移液器的头部不要接触到离心管的管内壁；用手拿取离心管时应该用拇指和食指轻轻捏住，将离心管有刻度的一面暴露出来以便随时能够观察到液面的变化。 ????????? 常用小型仪器的使用注意事项 离心机的功能是用来分离各种组分。离心力是衡量离心效率的重要指标，RCF（离心力）=0.000118×R×N2，其中R为转子的半径，N为转速，因而可见转速与离心力呈正相关的关系。一般来说，纯化DNA所需的离心力达到10000g就够了，纯化RNA需要8000g以上，纯化蛋白质则不一定，最高需要105 g以上。离心机在高速运转时一定要盖上盖子，千万不要用手去碰转子，否则会非常危险！ 电泳仪也是一种常用的实验仪器。电泳缓冲液一般用TBE或TAE，适当的电压为3-5V/cm，因此对于一个15cm的电泳槽来说，其电压可以达到近100V，因此在电泳时不可用手去触摸电泳液，以免触电。另外，还要注意电泳时电极不能接反。 质粒DNA的小量制备 提取质粒DNA的目的是将细菌质粒DNA与菌体染色体DNA分开，并去除菌体残片及蛋白，以获取质粒DNA。目前广泛采用的SDS碱裂解法，其效果良好、经济且收得率较高。碱裂解的原理：碱裂解抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性和复性的差异而达到分离目的。在碱性条件下，线性大分子细菌染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构互补链变性解开。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离。当用pH4.8的NaAc高盐缓冲液调其pH值至中性，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中为可溶状态。而染色体DNA不能复性，形成缠连的网状结构。通过离心将细胞碎片，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来被除去，质粒DNA则存在于上清中。采用此法可以得到足量的DNA，用于限制酶图的绘制、细菌转化、特定DN