重组DNA技术－基因工程及其与医学的关系-复旦《医用分子遗传学》课件.ppt

重组DNA技术－基因工程及其与医学的关系 复旦大学 分子医学教育部重点实验室 宋 后 燕 2009.11. RNA的单链骨架 RNA单链结构 DNA的单链骨架 DNA的四种碱基相互配对 DNA双螺旋结构 遗传信息传递的中心法则 一、 重组DNA技术 DNA限制性内切酶 核酸分子杂交 基因无性繁殖 核苷酸顺序分析 DNA限制性内切酶 DNA限制性内切酶粘性末端配对重组 核酸分子杂交基本原理   菌落原位杂交 DNA分子的重组  二、 基因工程的基本过程 1.制备基因 (1) 人工合成或PCR (2) 逆向转录 (3)从细胞的染色体DNA分离 PCR反应过程 利用PCR扩增基因 逆向转录制备双链cDNA 基因组DNA克隆 cDNA克隆  2.目的基因与载体重组 载体：质粒 Plasmid 噬菌体 Phage 粘粒 Cosmid 病毒 Virus 质粒及其药物抗性筛选用基因 质粒 pUC 19 穿 梭 质 粒 哺乳类细胞表达载体 How TOPO? Cloning Works λ 噬菌体的基本结构 天然?噬菌体基因组经改造去除非生活区DNA片段， 保留单个内切酶位点，如EcoR 1， 组装外源基因(10-20kb)。 克隆真核基因。 M13 噬菌体 Cosmid 粘粒的特点 含： ? 噬菌体 DNA COS 片段， 质粒复制起始位点， 药物筛选基因， 单个内切酶位点， 能组装大片段外源 DNA (20-45kb)， 克隆真核基因。 pLXSN反转录病毒表达载体 两种不同的人工染色体 1.酵母人工染色体 YAC (Yeast Artificial Chromosome) YAC Vector 含双臂 双臂中含：选择基因 端粒功能顺序 自主复制序列 克隆位点 180-1800 kb 两种不同的人工染色体 2.哺乳动物人工染色体 MAC (Mammalian Artificial Chromosome) 线性人工染色体 包含上述元件 Mb  外源基因与载体的连接方法： 相同的内切酶粘性末端 平头末端 人工接头 同聚物末端 人工接头的连接 3. 表达质粒转化宿主细胞 宿主细胞：大肠杆菌、枯草杆菌 …… 原核宿主 酵母菌 哺乳类细胞 ……真核宿主 昆虫细胞 转化方法：钙离子处理 电穿孔 基因枪 4.克隆的分离和鉴定 原核：1/药物抗性基因 5/选择性翻译 2/显色反应 6/捕获性翻译 3/原位杂交 7/免疫化学 4/DNA内切酶片段的长度 8/DNA顺序分析 真核：选择培养基 CHO-dhfr- 细胞  ?-半乳糖苷酶基因 ?-半乳糖苷酶 X-Gal(白色) 蓝色化合物