刀豆素A诱发小鼠急性肝损害模型的形态改变及Fas和FasL的表达.docVIP

刀豆素A诱发小鼠急性肝损害模型的形态改变及Fas和FasL的表达 　　刀豆素A(Concanavalin A, Con A)在体外可刺激T细胞进行有丝分裂，并释放细胞因子，诱导淋巴细胞及巨噬细胞的细胞素毒性［1］。而免疫性肝病病理变化的实质是T、B淋巴细胞介导的免疫损害，尤其是T细胞介导的细胞免疫在病毒性肝炎等疾病中是肝细胞损害的主要因素［2］。我们用尾静脉一次性注射一定剂量Con A的方法成功地建立了Balb/C小鼠特异性急性肝损害的动物模型，并对其病理损害机制作了初步的探讨。 材料和方法 　　一、实验材料 　　(一) 实验动物　雄性Balb/C小鼠，8～12周，体重20～27 g，第二军医大学动物中心提供。 　　(二) 主要试剂　Con A:美国Sigma公司；兔抗鼠Fas单抗及FasL单抗：美国Santa Cruz公司；羊抗兔IgG：上海医学化学检验所；LsAB试剂盒：丹麦DAKO公司提供。 　　二、实验方法 　　(一) 小鼠急性肝损害模型的建立　将Balb/C小鼠随机分成五组，A组(对照组)以0.25 ml注射用生理盐水代替，B、C、D、E组分别以每公斤体重10～40 mg Con A的剂量，以0.25 ml生理盐水充分溶解后尾静脉一次性注入，8 h后摘眼球放血，以2 500 r/min离心20 min后取血清待检，脏器用中性缓冲福尔马林液固定。 　　(二) 组织病理学检查　1. 肝脏等组织普通病理：常规HE染色，对A、B、D三组用病理指标评定肝损程度，病理指数的确定：在高倍镜下每次取20个视野，每一视野分三等份；“0”记整个视野无肝细胞病变；“1”记肝细胞发生病变1/3视野；“2”记肝细胞发生病变1/3～2/3视野；“3”记肝细胞发生病变2/3视野；20个视野得分相加即为肝细胞的病理指数PI值。2.链酶亲合素标记的辣根过氧化物酶显色法(S-P法)观察肝组织Fas及FasL表达：(1) 肝组织Fas表达：石蜡切片经二甲苯脱蜡至水，充分洗涤，微波抗原修复后冷却至室温，以LsAB试剂盒免疫组化检测，按说明操作。依次用正常兔血清(阻断)、兔抗鼠Fas单抗(反应)、生物素羊抗兔IgG(连接)、过氧化物酶-链酶亲合素反应，二氨基联苯胺(DAB)显色后，苏木素衬染。(2) 肝内FasL的表达检查：与检测Fas相同的免疫组织化学技术，改用兔抗鼠FasL单抗，以氨基乙基咔唑显色。(3) 实验对照：阴性对照：用PBS替代第一抗体设空白对照；用正常兔血清替代第一抗体设替代对照。阳性对照：用已知表达Fas及FasL的淋巴结为对照。(4)结果判定：阳性物质呈棕黄色，分布于胞膜和胞浆中，胞核经苏木素衬染为淡蓝色。 　　(三) 丙氨酸转氨酶(ALT)测定　赖氏法。 　　三、统计学处理 　　t检验，F检验，相关分析。 结果 　　一、不同剂量Con A作用8 h后ALT表达水平 　　在实验中观察到Con A 30 mg/kg及40 mg/kg用量组在用药后6 h左右出现少动，抓之无反抗，肢体逐步发凉，放出的血，血凝块收缩不良等，D组在7 h死亡1只。各组测定的ALT结果如表1所示。以Con A剂量为变量，以ALT为应变量的相关分析显示两者呈显著的正相关，相关系数r=0.59(P=0.002)，说明肝功能的损害对Con A具有剂量依赖性。 　　二、组织病理学观察 　　(一) HE染色　心、肺、肝、肾、脾等脏器HE染色结果显示只有肝组织有明显的损害。不同程度地表现为肝小叶结构欠清晰，肝细胞肿胀、变性，肝窦及中央小静脉淤血，部分肝细胞内有大的脂肪空泡形成，胞浆透亮，核固缩，小灶性坏死多见，肝内小血管中可见到较多的炎性细胞集聚。此外，单个肝细胞嗜酸性变非常普遍。用病理指数作为肝损的量化指标，B、D组分别为：41.5±9.2、45.5±7.8，随着Con A剂量的加大，PI有上升趋势，与对照A组10±4.2差异有显著及非常显著性。 表1　不同剂量Con A处理后小鼠血清ALT表在水平 组别 Con A量 (mg/kg) 实验只数 死亡数 ALT(U/L) A 0 6 0 62±19 B 10 6 0 1 405±807** C 20 6 0 3 182±1 494** D 30 7 1 8 933±4 076** E 40 7 0 10 229±9 071** 　　注：ALT值为±s　**P0.01 　　(二) 免疫组织化学　Fas在对照组和Con A处理组肝细胞表面及肝窦内皮细胞表面均有表达，但Con A处理组比较显著;FasL只表达于Con A处理组肝组织中，靠近中央静脉的肝细胞内表达明显。 讨论 　　Con A在体外能刺激T细胞分裂并释放各种细胞因子，诱导淋巴细胞和巨噬细胞的细胞毒性是其生物学特性之