第一节___基因工程原理.pptVIP

第一节 基因工程原理 一、基因工程概念：P5 二、基因工程的工具： 1、限制性内切酶 2、DNA连接酶 3、运载体 三、基因工程的一般程序 基因工程的工具 1、限制性内切酶 能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，形成黏性末端或平末端 基因工程的工具 2、DNA连接酶 将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶断开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 基因工程的工具 3、运载体 作为运载体必须具备四个条件：①能在宿主细胞中保存下来并大量复制；②有一个至多个限制酶切位点；③有一定的标记基因，便于进行筛选。如大肠杆菌割质粒携带的氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，就可以作为筛选的标记基因。④载体应对受体细胞无害。 常用的运载体主要有质粒（双链环状DNA分子）、噬菌体或某些病毒。 三、基因工程的一般程序 1、目的基因的获取 ①从基因文库中获取 ②利用PCR（多聚酶链式反应）技术扩增目的基因 目的——获取大量的目的基因；原理——双链DNA的复制；条件——需要DNA模板、引物、四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶和酶促反应所需的离子，同时还要控制温度；过程——高温变性、低温复性和中温延伸。③人工合成：如果基因比较小、核苷酸序列已知，可以通过DNA合成仪用化学方法直接合成。 三、基因工程的一般程序 2、重组载体的构建（基因工程的核心） 一个基因表达载体的组成：目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 在体外进行 用同一种限制性内切酶切割载体 通过DNA连接酶连接目的基因和载体 三、基因工程的一般程序 3、将目的基因导入受体细胞——转化①导入植物细胞：农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法等；②导入动物细胞：显微注射技术，即采用显微注射仪将目的基因注入受精卵；③导入微生物细胞：转化法。早期用原核生物作为受体细胞，以大肠杆菌应用最广。一般是将细菌用氯化钙处理制成感受态细胞，再与重组表达载体DNA分子混合，在一定温度下完成转化过程。 （标记基因表达性状代表导入成功。） 三、基因工程的一般程序 4、目的基因的检测与鉴定：分子检测与性状检测 （1）受体生物染色体的DNA是否插入了目的基因 方法：DNA分子杂交技术（DNA和DNA之间） （2）目的基因是否转录出mRNA 方法：分子杂交技术（DNA和mRNA之间） （3）目的基因是否翻译成蛋白质 方法：抗原—抗体杂交技术（抗原和抗体之间） （4）个体水平鉴定：包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性程度 * *