1.2_层析技术.ppt

1.2 层析技术 1.2.1 层析技术的原理和分类 1906年俄国植物学家M. Tswett将含有植物叶子色素的溶液，通过装填有白垩粒子吸附剂的柱子后，各种色素被分开。证明植物叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。分开的色素形成不同的色带，因此称为色谱法（Chromatography），又称层析法。 到1931年色谱法才用于分离复杂的有机混合物。 柱层析很难鉴定微量物质，因此发展了纸层析法（Paper Chromatography，简称PC）。在这种“平面”技术中，分离主要是通过滤纸上的分配来实现的。 利用平面层析法的优点发展了薄层层析法（Thin-Layer Chromatography，TLC）。 薄层层析的分离是在涂布于玻璃板或某些坚硬材料上的薄层吸附剂上进行。 通过施加电场可提高纸层析或薄层层析对离子化合物的分离效率，这种改进方法被称为纸上电泳或薄层电泳。 1941年英国生物学家Martin和Synge提出色谱塔板理论。这是在色谱柱操作参数基础上模拟蒸馏理论，以理论塔板来表示分离效率，定量的描述、评价层析分离过程。根据液－液逆流萃取的原理，发明了液－液分配色谱（Liquid-Liquid partition Chromatography）。 Martin和Synge预言：①流动相可用气体代替液体，与液体相比，物质间的作用力减小了，这对分离更有好处；②使用非常细的颗粒填料并在柱两端施加较大的压差，应能得到最小的理论塔板高（增加理论塔板数），将会提高分离效率。 气相色谱仪是1952年Martin和James发展起来的层析法，适用于分离气体混合物或挥发性液体和固体。具有分辩率高、分析迅速和检测灵敏等优点。 上世纪60年代末产生了高效液相色谱（High-Performance Liquid Chromatography，HPLC），适用于快速分离非挥发性或热不稳定样品。 色层分析法已不限于分离有色物质，但色谱法或色层分析法的名称仍被沿用。现称为层析法或层析技术。 层析法的特点是分离效率高，它能分离各种性质极相类似的物质。既可用于少量物质的分析鉴定，又可用于大量物质的分离纯化制备。 层析法作为一种分析分离手段与方法，广泛用于科研与工业生产上。如在石油、化工、医药卫生、生物科学、环境科学、农业科学等领域发挥重要作用。 1.2.1.1 层析技术原理 层析法是利用待分离混合物中各组分物理、化学及生物学特性的差异，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中，由于各组分随流动相前进的速度不同而被分离。 例如：利用物质在溶解度、吸附能力、立体化学特性及分子的大小、带电情况及离子交换、亲和力的大小及特异的生物学反应等方面的差异，使其在流动相与固定相之间的分配系数不同，达到彼此分离的目的。 分配系数是在一定的条件下，某种组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比值，常用K表示。分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据。 K=Cm/Cs Cm是流动相中的浓度，Cs是固定相中的浓度。 分配系数主要与被分离物质的性质、固定相和流动相的性质以及层析柱的温度有关。 一般情况下，分配系数与温度成正比。对于K值相近的不同物质，可通过改变温度来增大K值间的差异，达到分离的目的。 所有层析系统都由两个相组成： ①固定相是层析的一个基质。为固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等）或是固定于固体物质上的成分（如固定在硅胶或纤维素上的溶液）。基质可与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、交换等作用。对层析效果起关键作用。 ②流动相是层析过程中推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等。如水和各种溶剂。柱层析中的流动相一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。 当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，而且随流动相向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配。 与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。 与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。 分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。 以逆流分溶或逆流分配的方法来说明分配层析的原理。取一系列试管（称分溶管)，向第1号管加入互不相溶的两种溶剂，A溶剂为上相，作为流动相、B溶剂为下相，作为静相，并假设上下两相的体积相等。然后加入物质Y（Kd=1）和物质Z（Kd=3）的混合物（假设总量各为64份）。 对于层析柱可以假设： ①层析柱的内径和柱内的填料是均匀的，而且层析柱由若干层组成。每层高度为H，称为一个理论塔板。塔板一部分为固定相占据，一部分为流动相占据，且各塔板的流动相体积相等，称为板体积（Vm）。 ②每个塔板内溶质分子在固定相与流