PCR技术基因扩展技术.pptVIP

近年来PCR技术使分子生物学及相关学科发生了一次方法学的革命，在短短时间内在遗传病的产前诊断、病原体的检测、动植物检疫及DNA指纹识别、高科技生物医学领域中，PCR技术已具有一定的使用价值，且其应用范围仍在不断的扩大中…… 基因扩增技术--PCR PCR概述 PCR技术方法 常见PCR类型及应用 摘 要 一、PCR概述 定义：PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerase chain reaction)，是通过模拟体内 DNA 复制 的方式，在体外选择性地将 DNA 某个特殊区 域扩增出来的技术。 Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术。 1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年。 Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。 PCR历史回顾 生物样品 DNA片段 分子生物学 微生物学 基因工程产品 法医学检测 人类遗传学研究 …… PCR技术诞生所依赖的社会需求和研究需要 二、PCR的技术方法 PCR反应原理 PCR反应条件 PCR条件优化 PCR的影响因素 ①模板：单链或双链DNA ②引物：15-30 bp合成的寡核苷酸 ③DNA聚合酶：耐热的DNA聚合酶 ④底物：四种脱氧三磷酸核苷 （dNTP: dATP、dTTP、dCTP、dGTP) ⑤ Mg2+： DNA聚合酶的激活剂 PCR基本要素 PCR反应条件 总体积 50-100 ?l ①缓冲液 10 ?l ②dNTP（底物） 各200?mol/L ③引物 10~100pmol ④模板 0.1~0.2?g ⑤DNA聚合酶 2.5 ?l 反应体系 PCR反应条件 模板DNA 95℃ （1）、高温变性 PCR反应原理 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 50℃ 引物1 引物2 DNA引物 PCR反应原理 （2）、低温退火 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 引物1 引物2 DNA引物 72℃ Taq酶 Taq酶 PCR反应原理 （3）、适温延伸 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 第1轮结束 第2轮开始 95℃ PCR反应原理 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 72℃ Taq Taq Taq Taq 第2轮开始 PCR反应原理 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 第2轮结束 PCR反应原理 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 模板DNA 第1轮扩增 第2轮扩增 第3轮扩增 第4轮扩增 第5轮扩增 第6轮扩增 PCR过程示意图 ? 特异性强 ? 敏感性高 ? 快速 ? 简便 PCR特点 1 DNA聚合酶 ? Taq酶的热稳定性好 ? 没有3’?5’外切酶活性，因此不能修复错误的碱基配对！ ? 对金属离子敏感，尤其是Mg2+。 ? Pfu DNA Polymerase 有3’-5’的外切酶活性，是目前已发现的所有耐高温DNA聚 合酶中出错率最低的。 影响 PCR的因素 影响 PCR的因素 影响 PCR的因素 影响 PCR的因素 PCR条件优化 常规的优化方法: ? 有利于增加特异性的条件 降低Mg2+浓度、dNTP、Taq 酶、时间、 循环次数. ? 加入或优化增强剂：加入一系列辅助物如 DMSO(1%~10%)、PEG-6000 (5%-15%)、非离子去污剂、BSA等. PCR的条件优化 ? 优化引物设计、反应温度时间等。 ? 模板的纯化等 PCR的条件优化 三、常用PCR类型及应用 反转录PCR 荧光定量PCR 不对称PCR 反向PCR 反转录PCR（reve