临床PCR试剂盒的选用和质检.pptVIP

临床PCR试剂盒的选用和质检 卫生部临床检验中心 李金明 PCR或RT-PCR试剂盒的组成 核酸提取试剂 核酸扩增或逆转录-核酸扩增试剂 产物检测试剂（有些使用全自动分析仪的PCR方法因其核酸扩增和检测同时完成，故无专门的产物检测试剂） 影响PCR试剂盒质量的因素 内在因素: 原材料、核酸提取方法、方法学设计 影响PCR试剂盒质量的因素： 扩增所需的原材料 寡核苷酸引物和探针 缓冲液和dNTP 聚合酶、逆转录酶等 PCR反应混合物 寡核苷酸引物和探针 其对试剂盒质量的影响首先是纯度。纯度的判断可根据260/280吸光度比值来判断，如?2.0，则需重新纯化。另一种方法是将其在聚丙烯酰胺凝胶上电泳，如出现一条以上的带或迁移位置错误，则需重新纯化。 是否有污染。 结合特异性（浓度） dNTP和缓冲液 dNTP（包括dATP 、dCTP、 dGTP和 dTTP或 dUTP）的浓度 缓冲液：在储存和扩增循环中稳定、作为聚合酶活性所必须的Mg＋＋（或用于rTth的Mn＋＋）的浓度以及pH等 逆转录酶、DNA聚合酶 酶的浓度 酶的活性 核酸扩增方法 PCR RT－PCR 转录依赖的扩增（TMA） 连接酶链反应（LCR） 链替代扩增（SDA）等 影响PCR试剂盒质量的因素： 核酸提取 核酸提取的有效性 核酸提取的简便性 影响PCR试剂盒质量的因素： 产物检测 杂交固相 特异探针及其标记物 影响PCR试剂盒质量的因素 内在因素: 原材料、核酸提取方法、方法学设计 外在因素：试剂盒的运输和贮存外在因素：试剂盒的运输和贮存 试剂盒的运输和贮存 PCR试剂盒的有效期一般为6个月，这是指在适当的贮存温度下。核酸扩增部分的试剂一般要贮存于-20℃下；产物检测部分试剂则贮存于2～8℃。 试剂盒从厂家到用户手中，均要经历运输及运输中的贮存，任一环节的不当，均会影响试剂盒的临床使用质量。 PCR试剂盒的分类 定性测定：PCR-ELISA、PCR-膜上杂交（杂交梳）、荧光PCR（分子信标和Taq Man等） 定量测定： PCR-ELISA 、Taq Man和Amplisensor荧光定量、 Amplicor PCR-ELISA定量等。 PCR试剂盒的选用原则 参考试剂生产厂家的信息广告 参考同行对有关试剂盒的使用效果 参考有关机构的综合评价 根据使用目的 根据所在实验室的技术特点 根据所在医院患者的承受能力 PCR试剂盒的质检 外包装：厂家名称、检测目的、批准文号、批号和有效期等。 内包装：试剂瓶是否漏液、真空包装是否破损以、试剂是否齐全以及是否有使用说明书等。 PCR试剂盒的质检 采用血清（样本）盘（Panel）质检： PCR试剂血清（样本）盘由一定数量的原血清阴、阳性样本、2～3份纯化核酸（DNA或RNA或cDNA）样本以及3～5份系列稀释阳性样本所组成。样本总数可定在20份左右。 原血清样本用于判断试剂盒对特定病原体核酸检出的特异性、灵敏度和符合率；纯化核酸样本用于判断DNA扩增或逆转录及DNA扩增的有效性；系列稀释阳性样本用于判断试剂的测定下限。 试剂特异性、灵敏度和符合率计 算 公 式 试剂特异性、灵敏度和符合率计 算 公 式 灵敏度（％）＝ (a / a+c)?100% 特异性（％）＝ (d/b+d) ?100% 符合率（％）＝ (a+d/a+b+c+d) ?100% 谢 谢! * * Mg2+ Mn2+ dCTP dGTP dUTP dATP Taq DNA 多 聚 酶 rTth DNA 多 聚 酶 AmpErase 生 物 素 标 记 的 引 物 和 或 和