免疫学试验技术1.pptVIP

免 疫 学 实 验 技 术  Techniques for Immunology 概 论 免疫学技术 利用免疫学反应的特异性原理建立的各种检测与分析技术以及建立这些技术的各种制备方法。 包括 ： 免疫血清学技术 用于抗原或抗体检测的体外免疫反应技术； 细胞免疫技术 用于研究机体细胞免疫功能与状态的技术； 免疫制备技术 指制备与免疫检测有关制剂的各种技术。  一、细胞免疫技术  （一）淋巴细胞计数与分类 1. 淋巴细胞数量检测技术 1.1 T细胞E玫瑰花环试验 检测T细胞 T淋巴细胞表面CD2分子是绵羊红细胞（SRBC）受体，也称E受体，在一定条件下，SRBC环绕T细胞与之结合，形成花环状，称E花环（E-rosette），形成此种花环的细胞称E花环形成细胞。 1.2 EA玫瑰花环试验 检测B细胞 B淋巴细胞有表面Fc受体，以鸡红细胞作为指示细胞与相应的抗红细胞抗体形成EA，B淋巴细胞可以通过Fc受体与EA形成花环，以此计算B淋巴细胞的数目。 1.3 EAC玫瑰花环试验 检测B细胞 B淋巴细胞表面具有补体C3受体，红细胞可与相应的抗体结合形成抗原抗体复合物（EA），进而与补体结合( EAC)，然后与B淋巴细胞表面的补体C3受体结合而形成花环，以供计数B淋巴细胞。 1.4 酯酶染色法 ANAE+ 检测T细胞 T淋巴细胞的胞浆内存在着酸性a –醋酸萘酯酶(ANAE+ )，在酸性条件下，能使底物醋酸萘酯水解产生a –萘酚， 而a –萘酚与六偶氮副品红作用形成不溶性的红色沉淀物而沉积在T淋巴细胞胞浆内酯酶所在的部位。 2.T细胞亚群检测技术 T细胞总数：CD3；TH:CD4；Tc:CD8 应用针对CD抗原的单抗来鉴别各T细胞亚群。 2.1 间接免疫荧光法 分离淋巴细胞 CD单抗 荧光二抗 镜检计数 2.2 流式细胞术 分离淋巴细胞 CD单抗 荧光二抗 FACS测试管 计数 （二）淋巴细胞功能测定 淋巴细胞转化试验 淋巴细胞在体外培养时，受到非特异性有丝分裂原（如PHA、ConA）或特异性抗原刺激后，可出现代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加、细胞体积增大并能进行分裂的淋巴母细胞，此称为淋巴细胞转化现象。淋巴细胞转化率的高低，可以反映机体的细胞免疫水平，因此，可作为测定机体免疫功能的指标之一。 淋巴胞转化试验的方法有形态学方法、MTT法、3H-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）掺入法。 A、形态学方法 1、原理 淋巴细胞在体外培养过程中受有丝分裂原如植物血凝素（PHA）等刺激后，可转化为体积较大的母细胞，胞浆增多而深染，核增大并可见核仁部分细胞可出现有丝分裂，计数转化细胞的百分率可反映机体的细胞免疫功能。 2、方法 （1）取无菌肝素抗凝血0.1ml，加入1.8ml细胞培养液中，同时加入PHA（1000μg/ml）0.1ml，对照管不加PHA，将细胞置37℃、5%CO2培养3天，每天摇动1次。 （2）培养结束时吸弃大部分上清液，加入4mlNH4Cl（8.5g/L）混匀，置37℃水浴10min。 （3）2500r/min离心10min后弃去上清液，沉淀加5ml固定液，室温作用10min。 （4）离心（2500r/min，10min）后弃上清液，留0.2ml沉淀细胞制片，迅速吹干。 （5）吉姆萨染色10—20min，水洗，干燥。 （6）油镜计数200个淋巴细胞中转化的细胞数，计算转化率。 3、结果 （1）淋巴母细胞的形态学标准是细胞核的大小，核与胞浆的比例、胞浆染色性及核的构造与核仁的有无。 成熟的小淋巴细胞：与未经培养的小淋巴细胞一样为6—8μm，核染色质致密，无核仁，核与胞浆比例大，胞浆染色为轻度嗜碱性。 过渡型淋巴细胞：比小淋巴细胞大，约10—20μm，核染色质致密，但出现核仁，此为与成熟小淋巴细胞鉴别要点。 淋巴母细胞：细胞体积增大，约20—30μm，形态不整齐，常有小突出，核变大，核染色质疏松，有核仁1—2个，胞浆变多，常出现胞浆空泡。 其它细胞：如中性粒细胞在培养72h后，绝大部分衰变或死亡呈碎片。 （2）淋巴细胞转化率的计算　按上述分类检查推片头体尾三部分，计数200个淋巴细胞，算出百分率。 转化的淋巴细胞包括淋巴母细胞和过