HBV-DNA_PCR检测规程【精品】.docVIP

1　目的 规范LightCycler荧光PCR检测仪检测乙型肝炎病毒（HBV-DNA）的检验工作，指导检验人员正确进行乙肝病毒核酸定量的检测，保证检验结果的质量。 2　范围 本规程适用于LightCycler荧光PCR检测仪检测乙型肝炎病毒（HBV-DNA） 3　试剂 中山大学达安基因公司乙肝病毒(HBV)核酸扩增荧光检测试剂盒 4　仪器 Roche LightCycler荧光PCR检测仪 高速台式冷冻离心机 微量加样器（覆盖1-1000μl） 5　样品处理 样品处理按《PCR实验室标本处理规程》进行收集和处理，具体操作见本规程附录1和附录2。 6　测定 6.1 PCR扩增 6.1.1 打开稳压器电源，再打开计算机电源。 6.1.2 打开扩增仪电源，按仪器操作规程进入扩增循环条件设定。 6.1.3 将循环条件设定为： 程序 循环 温度 保持时间 1 1次 93℃ 2分钟 2 40次 93℃ 5秒 57℃ 45秒 3 1次 40℃ 0秒 6.1.4 检查反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。 6.1.5 将待反应的PCR反应管放入扩增仪中，并根据实际情况和仪器操作规程在程序中定好反应孔位置。 6.1.6 关闭扩增仪盖，按仪器操作规程开始循环。 6.1.7 扩增结束后关闭扩增仪电源，取出PCR反应管，密封放入垃圾桶。 6.2 产物分析 6.2.1 条件设置：反应结束后自动保存检测数据文件，调整荧光数值为F1/F2。点击Quantification读取结果。 6.2.2 基线的确定：取3～8个循环的荧光信号。 6.2.3 噪声容限（阈值）：调节在阴性质控品以上，要求在Step3：Analysis下相关性r值＜-0.97，接近-1.0。 6.2.4 对照标准：保证阴性质控品的Ct值不出现任何数值（默认为40）。 6.2.5 最后记录仪器自动分析计算出的未知标本数值（M），关闭计算机。 结果判断 7.1 如果Ct值＝40，则实验样品的UU DNA含量（基因拷贝数/ml）＜1×103。 7.2 如果Ct值＜40，则实验样品的UU DNA含量（基因拷贝数/ml）＝ M 7.3 检测样本中核酸阳性时，按实际结果报告；对可疑结果应复查，需要时与临床联系。 8　注意事项 8.1 各标本沸水浴时间误差不超过1分钟。 8.2 加样时每加完一个要立即盖上封闭好离心管。 9　支持性文件 9.1 《乙型肝炎病毒核酸扩增荧光定量检测试剂盒操作说明书》 8.2 《临床基因扩增检验实验室工作规范》 10　质量记录  附录1：HBV项目标本采集、运送流程图  附录2：HBV样本处理流程图 转置 阳性标准品的稀释及处理： 充分混匀 HBV-DNA PCR检测规程 第 5 页 共4页 注意手及其它外物勿接触到血或管、盖内壁 登记、接收 标本不合格 标本合格 通知临床重采样，并登记 咨询临床 标本不合格 标本有疑问 标本合格 实验室接收 如延误，存放于-20℃冰箱保存，保存期为6个月 立即送检 放至无菌的一次性无抗凝剂试管中，整个过程须注意勿溶血，管和验单均写上患者名字、盖好管盖。 护士抽取清晨空腹静脉血2-3ml 医生填好申请单 6,000rmp离心数秒 上机扩增 插入圆形卡盘倒置10秒 反应管6,000rpm离心20秒 标本运送用0℃冰壶 取上清2ul点样 10,000rpm离心5min 4℃充分裂解6-8小时 100℃沸水浴10min 充分振荡充分混匀 加入40ulDNA提取液 吸取上层血清40ul 将血清标本6,000rpm.离心20s 阳性标准品(1×108基因拷贝/ml) 以阴性质控品为稀释液将阳性标准品作107～104的倍比稀释 分别吸取阳性标准梯度和阴性质控管各40ul 以下步骤同标本处理 加40ul40ulDNA提取液