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实验十五 DNA的定量测定 一、实验目的 学习和掌握二苯胺法测定DNA含量的方法。 二、原理 核酸含量的测定方法包括紫外吸收法、定磷法和分别针对DNA和RNA的颜色反应方法。本实验采用针对DNA的二苯胺法测DNA的含量。在酸性溶液中，DNA与二苯胺共热生成蓝色化合物，该物质在595nm有最大吸收，在40～400mg/mL范围内其峰值与DNA含量成正比。 DNA + 三、试剂和器材 1. 试剂 200mg/mL DNA标准溶液、二苯胺试剂 2. 器材 可见分光光度计、恒温水浴锅、分析天平 四、操作步骤 1. 标准曲线的制作 取12只试管分成6组，按下表操作。取2管的平均值，以DNA浓度为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。 2. 样品的测定 取待测样品2mL，加入二苯胺溶液4mL，摇匀，60℃保温1h，然后在595nm波长出测定光密度值。根据测得的光密度值，从标准曲线上查得相应的DNA的ug数，按下式计算待测样品的DNA的含量。 DNA%＝ 五、注意事项 其他糖及糖的衍生物、芳香醛、蛋白质等都对实验有干扰，测定前应尽可能除去。 六、思考题 1、 DNA含量测定的方法有哪些？各有何优缺点？ 2、简述二苯胺法测DNA的基本原理。 * * 100℃ 冰醋酸，少量硫酸 蓝色物 4 0 2.0 5 光密度值 70℃恒温水浴中保温1h，冷却，在595nm波长处比色 4 4 4 4 4 二苯胺试剂/mL 0.4 0.8 1.2 1.6 2 蒸馏水/mL 1.6 1.2 0.8 0.4 0 标准DNA/mL 4 3 2 1 0 试管 待测样品中测得的DNA的mg数 待测样品液中样品的mg数 X 100
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