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分子生物学研究方法 PCR技术在医学中的应用 一.多聚酶链反应(Polymerase Chain Reaciton,PCR) （一）原理 热变性（94度） 引物 退火（55度） 延伸（72度） DNA聚合酶 dNTP 变性 退火 引物 经25~30次循环， 目的DNA增加166-7 （二）。PCR反应的主要成分和作用 1。DNA聚合酶：PCR反应使用的是耐热DNA聚合酶。 比如：Taq DNA聚合酶。 可分为两大类： （1）具有校正功能的（有3‘?5’核酸酶活性） 比如：Vent,pfu,pwo等 （2）不具有校正功能的 （无3‘?5’核酸酶活性） 比如：一般的Taq DNA聚合酶 2。引物 （1）引物长度以15~30个bp为宜。引物过短会使特异性降低， 过长时则成本增加，且也会降低特异性。 （2）引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶堆积现象， 引物G+C含量宜在45~55%左右。 （3）引物内部不应形成二级结构，两个引物之间尤其在3‘末端不应 有互补链存在。 （4）引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性。要求在引物设计时 进行辅助检索分析。 （5）引物3‘末端碱基：原则上要求引物3’末端与模板DNA一定要配对。 另外引物3‘末端的末位碱基在很大程度上影响着Taq DNA聚合酶 的延伸效率。研究表明，引物3‘末端碱基在错误配对时，不同碱基 的引发效率存在很大差异。当末位碱基为A时，即使在错配的情 况下，也能引发链的合成。而末位碱基为T时，错配时引发效率 大大降低。G,C居于中间，所以3‘末端的末位碱基最好选T,G,C而 不选A. (6) 引物5‘末端碱基：PCR反应物5’末端碱基并没有严格限制， 只要与 模板DNA结合的引物程度足够，其5‘末端碱基可以不 与模板DNA匹 配，而呈游离状态。这样引物设计时可以在5‘末端加上限制性内切酶 位点或其他短的序列。可以加ATG起始密码，可以加错配碱基造 成突变。 3。PCR反应缓冲液： 组成 50mM KCl 10mM Tris.Cl (pH 8.4) 1.5mM MgCl2 Mg++是Taq酶活性所必需的金属离子。 Mg++浓度的高低能影响反应 的特异性和扩增片断的产率。1.5~2.0mM Mg++是比较合适的。 Mg++ 过量能增加非特异性扩增并影响产率。 4。底物dNTP浓度 在PCR反应中，dNTP浓度应在20~200uM, dNTP浓度过高可加快反应 速度。同时，还可增加碱基的错误掺入率和实验成本。反之，低浓度 的dNTP会导致反应速度的下降，但可提高实验的精确性。此外，由于 dNTP可能与Mg++ 结合，因此应注意Mg++浓度和dNTP浓度之间的关系。 （三）．怎样提高PCR的特异性 1．热启动（hot-start) 比如（1）将Taq酶与其它反应体系通过石蜡分隔开 （2）利用Taq酶的单克隆抗体抑制其活性。 2. Touchdown 先在高于退火温度下进行几轮PCR循环，然后再在 退火温度下进行大量扩增。 3. Nested PCR 先在要扩增片断的外侧设计一对引物，进行PCR，然后以此PCR产物为模板，再在内侧设计一对引物扩增出我们所要的目的片断。 二 PCR的应用 （一）未知DNA片断的克隆 1，基因组DNA步移法 1 2 3 4 5 已知DNA序列 接头 接头 PCR 2，Inverse PCR 限制酶切点（X） 限制酶切点（X） 已知序列 限制酶X酶切 连接 引物2 引物1 PCR (二）利用PCR对基因功能进行 分析和改造 (三） 基因拼接 （四）In vitro evolution of gene- coding protein DNA Shuffle 基本过程 1．Preparation of genes to be shuffled 2．Fragmentation with DNase I 3．Reassembly by thermocycling in the presence of a DNA polymerase 4．Amplification of reassembled products by a conventional PCR 怎样提高高保真的重组体 1．在步骤2）使用Mn