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第一章 基因工程的主要技术原理 第一节 DNA的提取与纯化 由于提取DNA的目的、种类、所用的生物、组织材料、实验条件等不同，DNA的提纯有很多方法。其中最常用的是碱抽提法。 一、质粒DNA的提取 1 .碱抽提法提取质粒DNA （1）原理 闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快； 染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。 （2） 所用的试剂作用 ① 溶菌酶 能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的(-1，4糖苷键。 在碱性条件（pH8）下有活性。 ② 葡萄糖 增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。 ③ EDTA Mg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。 ④NaOH-SDS NaOH：强碱，提供pH12的碱性条件，使DNA双链变性。 SDS: 溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白—SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。 ⑤ NaAc-HAc缓冲液 冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8。 用来中和NaOH变性液，使DNA复性。 高浓度的NaAc有利于变性的大分子（蛋白质、DNA、RNA等）沉淀。 ⑥ 乙醇 用于沉淀DNA。 DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA ⑦ RNase A 降解RNA渣滓。 以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。 ⑧ TE缓冲液 DNA保存液。 由Tris-HCl和EDTA配制。 Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲液），有利于以后操作； EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。 ⑨ 酚-氯仿 选用 蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。 但苯酚会残留在DNA溶液中。 （现多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。 （3）碱抽提法提取质粒DNA的步骤 第一步：溶菌 使用“溶液Ⅰ”溶解细菌细胞壁。 Solution I 的配制： 50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl(pH8.0)， 10mM EDTA， 4-5mg/ml溶菌酶， RNase A 第二步：破膜，蛋白质和DNA变性 溶液II 破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。 Solution II 的配制： 0.2N NaOH，1.0%SDS 第三步：中和 溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复合物和染色体DNA、RNA沉淀。 Solution III的配制： 3M 醋酸钠（用冰醋酸调pH至4.8） 二、基因组或其他DNA的提取 1.细菌基因组DNA的制备 一般过程及原理： （1）细胞裂解 10%SDS和蛋白酶K。37 oC温育。 不用NaOH ! （2）DNA纯化 CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)除去多糖，酚-氯仿-异戊醇除去蛋白质。 （3）沉淀DNA 0.6倍体积的异丙醇。 2. 哺乳动物细胞基因组DNA的抽提 一般过程及原理： （1）组织粉碎 动物组织剪成小块，置液氮中冻结后研磨成细粉末。组织培养的细胞用胰酶消化松散后直接使用。 （2）细胞裂解 0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50 oC温育。 SDS是离子型去垢剂（detergent），可以使细胞膜崩解。 （3）纯化DNA 用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。 （4）沉淀DNA 用2倍体积的无水乙醇。 （可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀） （5）除去RNA污染 3. 从植物组织中制备 DNA 一般过程及原理： （1）组织粉碎 用液氮冷冻后研磨成细粉末。 （2）细胞裂解 用2%CTAB/2-ME (十六烷基三甲基溴化铵/2巯基乙醇）。 或1% SDS和蛋白酶K。 用RNase。 （3）纯化DNA 用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。 （4）沉淀DNA 用0.6倍体积的异丙醇（-20 oC）（可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀） （5）除去RNA污染 用RNase A 三、DNA的定量和纯度测定 1. 紫外光谱法 原理： DNA（或 RNA）在260nm波长处有特异的紫外吸收峰，1 OD的光密度相当于双链DNA浓度为50μg/mL。 蛋白质在280nm处有吸收峰 取3ml去离子水，加入比色皿，再加10ul的质粒，用1ml的移液枪充分混匀。用比色杯在紫外分光光度计直接测定。 1、根据OD值计算DNA浓度（μg/mL ） [dSDNA]=50×（OD260-OD310）×稀释倍数 其中260nm读数用