基因功能分析的基本策略硕士.pptVIP

基因功能分析的基本策略 第一节 转基因技术transgenic technology 电击法 在外加电场的作用下，细胞膜电位发生改变，细胞质膜瞬间出现可逆性的电穿孔，从而使一定数量的外源DNA从细胞外扩散到细胞质和细胞核内，并进一步整合到宿主DNA上，达到转基因目的。 显微注射法 将外源DNA在显微操作系统的辅助下，直接将外源DNA注入哺乳动物受精卵的原核内，使外源基因整合到基因组上，制备转基因动物。 基因枪法 将要转染的DNA吸附到高黏度的金属颗粒上，在加速装置的作用下，将这些粒子高速打入细胞或组织内，达到转基因目的。 磷酸钙法 将待转染的DNA溶解在磷酸缓冲液中，使DNA片段与磷酸钙共沉淀并形成大的颗粒；加入贴壁培养的细胞中被吸收，实现转基因。 第二节 RNA干扰技术RNA Interference (RNAi) RNAi实例(载体法)： Target gene：c-myc 查找靶基因mRNA 利用网络在线支持，寻找siRNA序列 根据查找的siRNA序列，合成长链oligo 构建载体 转染 检测效应（包括干扰效应和生物学效应） 2、/  3、其它网站 载体构建： dsDNA形成：退火  载体的酶切和回收 连接 转化 鉴定转染：瓶颈之一 含有真核细胞筛选标志 含有荧光标志效应检测：mRNA水平和蛋白水平兼顾 RNA干扰的应用基因治疗方面 抗肿瘤—— 应用RNAi技术抑制肿瘤细胞血管生长因子如血管生成素、angi1、angi2、angi3及VEGF等或其受体的表达，抑制肿瘤细胞癌基因bcl2、RAS、Tp53等突变基因及其蛋白的表达达到抗肿瘤生长及转移的目的 抗器官移植排斥反应 —— 细胞间粘附分子-1（ICAM-1）是重要的介导细胞粘附和T细胞激活的分子，应用与ICAM-1基因序列特异的siRNA阻断 ICAM-1 mRNA和蛋白的表达，可以明显降低大鼠同种移植心的移植物血管病的发生的程度和缺血再灌注损伤。 抗病毒—— 斯坦福医学院运用此技术来治疗丙型肝炎 把dsRNA转入小鼠的肝细胞，被分解成siRNA后与小鼠体內的丙型肝炎病毒mRNA相结合，使之分解并失去转译蛋白质的功能。 已从体外试管实验阶段推进至体內的动物实验 且在小鼠模型看到丙型肝炎病毒被阻断的明显效果 利用siRNA治疗疾病需要解决几个问题： 导入问题：使用高效载体传递siRNA； 给药方式：因为RNA容易被降解，如何提高siRNA在体内的稳定性； 高选择性：如何靶向特定细胞而不影响其他细胞。 第三节 基因敲除技术Gene Knock-out 通过DNA同源重组 定向将外源基因插入宿主细胞染色体DNA中 从而使特定目的基因在细胞内或生物体内失活 Embryonic Stem Cells 同源重组 target targeting vector homologous recombination “knockout” TK 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 5′ 5′ 5′ 3′ 3′ 3′ 3′ 待剔除基因 克隆 克隆载体 重组载体 切割基因使待剔除基因失去活性 阳性标记基因Neor 连接 HSV-tk 打靶载体 打靶载体 内切酶消化 线性化打靶载体 转染 基因组 同源重组 同源重组的胚胎干细胞 胚泡 植入 假孕小鼠 杂合子小鼠 正常小鼠 杂合子小鼠 交配 杂合子小鼠 兄妹交配 纯合子小鼠（基因剔除） RNA诱导沉默复合物 RISC对靶mRNA的切割是以内切的方式进行的，而且切割仅发生在与siRNA同源的部分。 RNAi的要素：RISC RISC: RNA-Induced Silencing Complex Exonuclease Homology search activity Endonuclease Helicase 5’ 3’ Target mRNA OH3’ 5’P 形成RISC复合物，降解目的mRNA dsRNA Dicer cleavage of dsRNA siRNA RNAi 抑制基因表达的机理 siRNA associated With RISC complex Cell Membrane 5’P OH3’ Target mRNA RNAi机制 Dicer RISC 碱基互补 酶解 RNA干扰实验的基本过程 1. 确定干扰靶点 干涉靶点序列应具