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实验二 质粒DNA提取 (碱裂解法) 实验目的 实验原理 实验仪器、材料与试剂 实验步骤 实验结果及讨论 实验目的 了解碱裂解法提取质粒的原理； 掌握碱裂解法提取质粒的方法。 实验原理 质粒：是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子。 碱裂解法提取质粒：是实验室常用的方法。这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。 载体 基因工程中，携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具称为载体，主要有大肠杆菌中的质粒、λ噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒等 作为基因工程用的载体必须具备以下条件： 起始复制子 有一个或多个利于检测的遗传表型 有一系列限制性内切酶的单一识别位点（多克隆位点） 适当的拷贝数 结构的三大要素： 多克隆位点 选择标记（耐药性，LacZ） 独立的复制子 种类： 质粒 噬菌体 酵母人工染色体（YAC） 反转录病毒载体 表达载体等 质粒 质粒是基因工程中常用的载体之一，是染色体外小型双链环状DNA，大小在1～200kb之间，存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多 T-载体 在碱性条件（pH 12.5）下，细菌的线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一起。当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA分子很快复性，离心时染色体DNA、细胞碎片、蛋白-SDS一起被沉淀下来，而质粒DNA则留在上清液中。 RNA通过胰RNA酶水解 用乙醇沉淀并洗涤，可得到较纯的质粒DNA。 碱裂解法 实验仪器、材料与试剂 （一） 仪器 1. 恒温摇床 ：培养细菌使质粒扩增 2. 超净工作台 ：在培养基中接种细菌 3. 高压灭菌锅 ：防止其它细菌的污染 4. 台式离心机 ：沉淀细菌、分离质粒与细菌DNA以及蛋白 5. 微量移液器：吸取一定体积的溶液 （二） 材料 含pGEXP-4T质粒的大肠杆菌 DH 5α。 —已转化 含重组质粒的大肠杆菌 DH 5α。 —已培养 （三） 试剂 LB液体培养基 胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5 g NaCl 10 g 加去离子水至800ml 搅拌，使溶质完全溶解，用NaOH调节pH值至7.0，加入去 离子水至总体积为1升，高压蒸汽灭菌20 分钟。 LB固体培养基 在上述LB液体培养基（1L）中加入琼脂粉15g。 1. SolutionⅠ 　 50 mmol/L 葡萄糖 　 25 mmol/L Tris.·Cl (pH 8.0) 　 10 mmol/L EDTA (pH 8.0) 高压灭菌后，4℃保存备用。 2. SolutionⅡ (现用现配，pH12-12.5) 0.2 mol/L NaOH 　 1% SDS 3. Solution Ⅲ（pH 4.8） 5mol/L KAc 60 ml 冰醋酸 11.5 ml 水 28.5 ml 配制成的溶液Ⅲ含3 mol/L钾盐、5 mol/L醋酸 5. 胰RNA酶 : 去除细菌RNA 将胰RNA酶（RNA 酶 A）溶于10 mmol/L Tris.Cl (pH7.5)、15 mmol/L NaCl中， 配成10 mg/ml的浓度，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。 6. 酚:氯仿：进一步去除上清中的细菌蛋白和脂类 70%乙醇：洗涤以去除沉淀中带有的少量盐和蛋白 7. 氨苄青霉素（Amp） 用无菌水配制成100 mg/ml 溶液，小份分装后置 20℃冰箱保存备用。 实验步骤 将50mL含氨苄青霉素（100μg/mL）的LB液体培养基加入100mL锥形瓶中，接入含R-pGEX-4T-1质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜（12h-16h） 收菌，吸取1.4mL培养物加入1.5mL离心管中，5000r/min室温离心1min 吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥 将细菌沉淀悬浮于100μL溶液Ⅰ中，充分混匀，室温放置8min 加入200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧盖子，混匀内容物，将离心管放冰上5min 加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧盖子，颠倒数次使混匀。冰上放置10min 12000r/min离心8min，将上清转至另一离心管中 向上清中加入等体积酚:氯仿（1：1），反复混匀，1