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1、质粒提取及琼脂糖电泳鉴定碱法质粒抽提的三种溶液溶液I：50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0Tris-Cl溶液为了控制好溶液的pH。50 mM葡萄糖是使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，作用是抑制DNase活性和抑制微生物生长。 溶液II：0.2 N NaOH / 1% SDS 新鲜的0.4 N的NaOH（保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱碱性）和2％的SDS等体积混合。破细胞的主要是碱而不是SDS，所以称碱法抽提。NaOH引起细胞膜从双层膜结构向微囊结构的相变化，因而可使大肠杆菌细胞瞬间溶解。只用SDS也能抽提得到少量质粒，由于SDS的碱性较弱。加SDS。这一步要控制时间不能过长，因为碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；同时必须温柔混合，不然会引起基因组DNA断裂而带来麻烦。 很多人误以为NaOH的作用是为了让基因组DNA变性以便沉淀。 溶液III3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸1.5ml培养物加入Eppendorf管中，12000r/min，30sec。 2、倒去吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。 3、将细菌沉淀悬浮于100μl预冷的溶液I中，剧烈振荡。 4、加200μL溶液II（新鲜配制），盖紧Eppendorf管，快速颠倒5次，混匀内容物，将Eppendorf管放在冰上5min。 5、加入150μL溶液III（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置5min。 6、12000r/min，离心5min，将上清夜转至另一Eppendorf管中。 7、向上清夜加入800μL无水乙醇，混匀后，室温放置5-10min。12000r/min离心5min。倒去上清夜，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 8、用1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清夜，真空抽干或空气中干燥。 9、20μL TE缓冲液，使DNA完全溶解（-20℃保存） 质粒DNA酶切及琼脂糖电泳鉴定 TBE缓冲液（5×）：用时需稀释10倍 点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油 溴乙啶染色液(EB)：10mg/ml溴乙啶 注意：该试剂具致癌作用，用时要小心。 琼脂糖 操作步骤 质粒DNA酶切 按下表将各种试剂加入Eppendorf管中。质粒DNA/(l 0.5 Buffer（10×）/(2 ddH2O/(l 9.5 加样后混匀，置于37水浴中，保温小时。然后每个管中迅速加入2( EDTA 终止反应。 琼脂糖凝胶电泳 称0.4g琼脂糖加入40ml 0.5TBE缓冲液中加热熔解。冷却至60加。在一端插好梳子。待凝胶完全凝固后，垂直拔掉梳子将凝胶槽移至电泳槽。电极缓冲液要高出凝胶面2～。 样每个样品中加入1/10体积Loading buffer（10×），混匀后小心地加入样品槽中，要避免相互污染。 电泳接通电源，电压为80V，电泳左右，当溴酚蓝到达下沿12㎝处时，停止电泳。 (g/mL的EB中染色10min。 观察及照相将胶板拿出，用凝胶成像系统照相。 感受态细胞的制备及转化 操作步骤 感受态细胞的制备(0.1CaCl2方法) 从LB固体平板挑单克隆于5ml LB液体培养基中(不加抗生素)，37×200rpm×12～16h，可过夜培养。 将活化菌体按1～5％接种到LB中，扩大培养37×200rpm×2h，至OD600约为0.4。 取培养好的菌液1.5 ml于一离心管中，4 离心8 000rpm1min。 弃上清，加500 ( 0.1 mol/L CaCl2 (灭菌预冷)洗菌体，4冷冻离心8000rpm1 min。 彻底除去残液，加200 ( 0.1 mol/L CaCl2 (灭菌预冷)，悬浮菌体。 冰浴静置30 min ，4冷冻离心8000rpm1 min。 弃上清，加100 ( 0.1 mol/L CaCl2 (灭菌预冷)，悬浮菌体，即为制备好的感受态细胞。 附注： 、LB液体培养基建议用不加抗生素和加抗生素的两种培养基，检查菌体是否污染 、D600值指细胞密度，用于判断培养物是否处于对数生长期。OD600值在0.40.5时，此时培养物处于对数生长期，细胞数在20min内加倍。 、注意无菌操作和保持低温。 、培养物处于对数生长期是制备感受态细胞的关键。 、如果要求高转化效率，不建议使用简单深冻保存的感受态细胞。 质粒对大肠杆菌的转化 1、将连接产物加入100 (制备好的感受态细胞，冰上放置30 min。 2、42热激90S。 3、迅速冰浴3min。 4、加入300( LB液体培养基，37轻摇培养45min。 5、加入30( X-gal和6 ( IPTG，混匀。 6、取