[武汉大学基因工程（李立家）课件]2012x.pptVIP

* * 第五章大肠杆菌基因工程 克隆复制DNA---------E.coli 表达应用基因---------E.coli 植物 动物 人 基因工程中使用大肠杆菌作为受体的目的用途以及相应的原因？ 5．1大肠杆菌表达系统优缺点 优越性:(1)结构简单，生理生化和遗传背景知识，尤其是 其基因表达调控机制有了清楚的了解；(2)易于大规模培养， 成本低廉；（3）经过了遗传改造，已发展为一种安全的基因 工程实验系统，拥有各种不同的菌株和载体系列。 不足之处（表达真核基因的障碍）:（1)真核基因具有内含 子，所以只能用其cDNA；（2）许多真核生物基因仅在大肠杆 菌中合成无特异性空间结构的多肽链；（3）许多真核基因的 蛋白质产物，都要经受翻译后的加工修饰，而大肠杆菌缺乏蛋 白质加工系统；（4）大肠杆菌内源性蛋白酶易降解外来的真 核生物基因所表达的蛋白质分子；（5）大肠杆菌细胞膜间隙 中含有大量的内毒素，痕量的内毒素即可导致人体热原反应。 5．2外源基因在大肠杆菌中的高效表达原理 涉及三个方面：（1）强化蛋白质的生物合成（重组质 粒的拷贝数，转录水平和翻译速率）；（2）抑制蛋白质产 物降解；（3)恢复维持蛋白质特异性空间结构。 目的基因与表达成分的拼接 5．2．1 启动子 影响表达效率的主要因素之一是启动子的强度，启动子的 强弱取决于：（1）启动子本身的序列，尤其是-10区（TATAAT） 和-35区（TTGACA）两个六聚体盒的碱基组成；（2）-10区和- 35区的间隔距离，接近于17个碱基对，启动子活性强度也就越 强，若大于17，则启动子活性强度也就越弱；（3）与启动子 和外源基因转录起始位点之间的距离有很大关系。 高水平表达的最佳启动子必须具备的条件：（1）它必须 是一种强启动子，能够使克隆基因的蛋白质产物的表达量占细 胞总蛋白的10％-30％；（2）这种启动子应该是诱导型的，能 通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导。 两类启动子：（ 1）大肠杆菌RNA聚合酶特异识别的启动子，如 Plac，Ptrp，Pl，和 Ptac ， PlacUV5是野生型Plac启动子的突变体，它 含有一个突变碱基对，其活性更强；（2）T7噬菌体编码的RNA聚 合酶识别的T7噬菌体DNA启动子?10。启动效率取决于RNA聚合酶 与启动子的作用强度，而转录效率不仅与外源基因在单位时间内 的转录次数有关，而且还受到转录启动后RNA聚合酶沿DNA模 板链移动速度的影响。 T7噬菌体RNA聚合酶比大肠杆菌RNA聚 合酶聚合mRNA快5倍。 如何利用T7噬菌体RNA聚合酶在大肠杆菌中表达外源基因？ pET表达载体系列：装载T7启动子并在T7 RNA聚合酶驱动下表 达外源基因的大肠杆菌质粒。 5．2．2 终止子 有效的转录终止子的必要性：（1）转录产物越长，所需 时间就多，外源基因本身的转录效率下降；（2）转录通读进 入质粒功能区，可能干扰质粒的复制和其他生物功能，甚至 导致重组质粒的不稳定性；（3）转录终止子能增强mRNA分子 的稳定从而大大提高了蛋白质产物的水平；（4）转录产物过 长影响翻译效率。 5．2．3 SD序列 外源基因在大肠杆菌中的高效表达不仅取决于转录启动 频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。 大肠杆菌mRNA的翻译起始效率主要由其5‵端的结构序列所 决定，即核糖体结合位点（RBS），它包括4个结构要素： （1）起始密码子上游的6-8个核苷酸序列UAAGGAGG, 即Shine-Dalgarno(SD)序列；（2）起始密码子AUG；（3）SD 与起始密码子之间的距离及碱基组成；（4）基因编码区 5‵端若干密码子的碱基序列，至少这一序列不能与mRNA的 5‵端非编码区形成茎环结构，否则便会严重干扰mRNA在核糖 体上的准确定位。 5．2．4 密码子 由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有不同程度的差异性，因此，外源基因尤其是哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。一般而言，有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：首先，采用外源基因全合成的方法，按照大肠杆菌密码子偏爱性规律，设计更换外源基因中不适宜的相应简并密码子，重组人胰岛素，干扰素以及生长激素在大肠肝菌中的高效表达均采用了这种方法；其次，对于那些含有不和谐密码子种类单一，出现频率较高而本身分子量又较大的外源基因而言，则选择相关tRNA编码基因同步克隆表达的策略较为有利。 5．2．5质粒拷贝数 提高产量除了使用强启动子以提高转录效率外，还可以 增加质粒拷贝数以增加基因的剂量，这可以通过构建高拷贝 载体而实现。 质粒的