细胞生物学的研究方法.pptVIP

生命科学中所讲的荧光是指当用一定波长的光去照射荧光物质时，或者用我们的话来说去激发这个荧光物质时，这个物质就会发出与激发光颜色不同的光，我们把这种光叫荧光。 某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下可以放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。 从光学显微技术到电子显微技术，再到扫描隧道显微镜是显微镜发展的一个先后顺序，也是分辨率更清楚地发展过程。 中山大学王金发教授 四川大学王喜忠教授 北京大学丁明孝教授 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 扫描电镜的成像原理 工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出二次电子，二次电子的多少与样品表面结构有关，二次电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。 SEM LIGHT PATHWAY 为了使标本表面发射出二次电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出二次电子信号。 人类红细胞 免疫电镜技术： 免疫胶体金技术 细胞内对于蛋白质分子的定位技术包括免疫荧光和免疫电镜等，这些技术都是基于免疫学中抗原抗体特异性反应的原理而设计的。将抗体分子上加上不同的可供识别的标记，从而显示出某种蛋白质在细胞内的分布和定位。 （四）扫描隧道显微镜scanning tunneling microscope，STM 原理：根据隧道效应设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV~2V），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。 分辨率：横向为0.1~0.2nm，纵向可达0.01nm。 用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。 扫描隧道显微镜观察的DNA双螺旋结构 Scanning Tunneling Microscope, STM 第二节 细胞组分的分离与分析 一、超速离心技术 用途：因为不同的细胞器和分子有不同的体积和密度，可在不同离心力的作用下分离细胞器与生物大分子及其复合物。 差速离心：分离密度不同的细胞组分 密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离 Low speed High speed 1.差速离心 Differential centrifugation 特点： 逐级提高离心速度，分离 不同大小（密度）的细胞器。 1.差速离心 Differential centrifugation 用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。 沉降顺序：核 —— 线粒体、溶酶体、微体 ——质膜、内质网与高基体 —— 核蛋白体。 可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。 2. 密度梯度离心 原理：用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。 这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。 常用介质：蔗糖、甘油。 2. 密度梯度离心 （1）速度沉降 速度沉降主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。这种降方法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。 生物颗粒（细胞或细器）在十分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。 2. 密度梯度离心 （2）等密度沉降 等密度沉降适用于分离密度不等的颗粒。 细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和是够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。 等密度沉降通常在较高密度的介质中进行。介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度，而且介质的梯度要求较高的陡度，不能太平缓。再者，这种方法所需要的力场通常比速率沉降法大10~100倍，故往往需要高速或超速离心，离心时间也较长。大的离心力、长的离心时间都对细胞不利。因此，这种方法适于分离细胞器，而不太适于分离和纯化细胞。 密度梯度离心 二、 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法 利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。 1. DNA特异性的显示方法 Feulgen反应： 利用酸水解去除细胞中的RNA，仅保留DNA，并且除去DNA嘌呤脱氧核糖核酸的嘌呤，使脱氧核糖的醛基暴露，所暴露出的自由醛基与希夫试剂反应呈紫红色。 2. 多糖的显示方法 PAS（过碘酸希夫氏）反应 利用过碘酸的强氧化作用破坏糖分子的C—C键