免疫血清论文.docxVIP

本科生课程论文课程名称 ： 生物技术大实验 指导教师 ： 刘金林 姓 名 ：杨玉祥 2009211603 莫小妍 2009211584 冉美蓉 2009211589 许文彬 2009211601 专 业 ： 生物技术 生命科学学院2012年6月11日小鼠鸡血红蛋白抗体和家兔APP抗体的制备及效价检测摘 要：抗体(Antibody)，是一种由B细胞分泌，被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的大型Y形蛋白质，仅被发现存在于脊椎动物的血液等体液中，及其B细胞的细胞膜表面，其可与相应抗原发生特异性结合，在医药、生研究物等各个领域都有着广泛的应用。本实验对常见实验动物家兔和小鼠注入抗原，采取皮下、腹腔的注射方法以分别制备BSA抗体和鸡血红蛋白抗体。在产生足够的抗体后，再运用凝集实验、琼脂双扩散实验以及ELISA和Western blot测定所产生抗体的效价，以评判抗体制备的效果。关键词：抗体 APP 鸡血红蛋白 制备 效价检测免疫活性细胞表面有抗原受体能够识别抗原，在每个淋巴细胞表面中只有一种抗原受体，只能识别一种抗原，当抗原和受体结合后，抗原刺激淋巴细胞增殖、 分化而产生免疫应答。受抗原刺激的淋巴细胞，在分化过程中，还有一部分细胞 在中途停顿下来，不再增殖分化，成为记忆细胞，在体内能较长时间存在。当这 类细胞再次受到同种抗原刺激时，能迅速分化增殖成大量致敏淋巴细胞和浆细 胞，分别产生大量淋巴因子及抗体。所以将具有完全抗原性的物质注入健康的动 物机体后，动物体内便会产生相应的抗体。待动物血清中存在大量抗体时，采集 动物血液，分离析出血清，便得到所需要的抗血清(免疫血清或抗体)。在本实验中，我们利用佐剂(免疫调节剂或免疫增强剂)和抗原相结合，注入兔子体内，得到相应的APP抗体；同时向小鼠体内注入鸡血制备鸡血红蛋白抗体。在实验中利用了凝集实验测定鸡血红学蛋白抗体效价，利用琼脂双扩散实验、ELISA以及蛋白印迹(Western blot)测定家兔APP抗体效价。1. 实验内容1.1 抗体的制备抗体(antibody, Ab)，属于免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)，是机体在抗原物质刺激下所形成的一类能与抗原特异结合的血清活性成分，是机体免疫细胞被抗原激活后，由B细胞分化成熟的浆细胞合成、分泌的一类能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白[1]。Ig是抗原刺激和机体免疫系统所产生的在体液免疫应答中发挥主要作用的免疫分子，其重要功能是识别并特异性结合和清除相应抗原，这些功能是由Ig分子的V区和C区共同完成的[1]。本实验选用家兔与小鼠作为免疫动物，分别制备APP抗体(颗粒性抗原＋可溶性抗原)，与1％鸡红血球抗体。1.1.1 小鼠鸡血红蛋白抗体的制备1.1.1.1 小鼠免疫采用鸡红血球免疫小鼠，细胞数量不低于1×106。每次取制好的鸡红血球抗原可对小鼠采用皮下、皮内和肌肉多点注射(每点0.05～0.1ml)，还可通过腹腔注射(0.5ml)，总量不超过1ml/只。一共三次，每次间隔一周时间。小鼠免疫的过程中，要注意小鼠的抓取和腹腔注射的方法(图1、2)，戴好手套，注意实验安全[2]。图1 抓取小鼠 图2对小鼠进行腹腔注射1.1.1.2 小鼠免疫血清的分离在完成既定免疫方案后，即末次免疫7天后，采集免疫动物的血液，分离血清并对血清进行保存。1.1.1.2.1 小鼠拔眼球放血右手提免疫后小鼠的鼠尾，鼠头朝下将鼠旋转离心甩动1min，用镊子拔去一侧鼠眼球，并将鼠倒置，头向下，使血液流出，将鼠血滴入1.5mL无菌离心管中，收集鼠血。1.1.1.2.2 小鼠血清的分离(1)将血液置室温中放置，使血液凝固，血块收缩；(2)待鼠血凝固后用无菌移液管吸取上层血清，转移至1.5mL无菌离心管中；(3)在4℃下2500g离心30min，取上清液即可。1.1.1.2.3 小鼠抗血清的保存将取好的上清的离心管放入?20℃保存。一般保存5年抗体效价不会有明显下降。抗体切忌反复冻融，反复冻融会使抗体效价显著降低。抗血清保存在装有血清的2ml离心管上做好标记，放入离心管盒，保存于?20℃[3]。1.1.2 家兔APP抗体的制备1.1.2.1 家兔免疫用正确的方法捉拿家兔(见图3)，采用牛血清蛋白免疫家兔，蛋白抗原量为0.2-1mg/次。在免疫动物时，先将1ml抗原(蛋白质抗原浓度为0.01-1mg/mL，用生理 盐水或缓冲液溶解)与1ml弗氏佐剂混合，于涡旋仪上振荡：先低速振荡 2min、 再逐渐挑高速度，约5～10min。可将一滴乳化好的液体滴在水面上(冷水中)，如能长时间保持圆珠形而不散开，表示乳化达到要求。然后将2ml佐剂抗原在 背部皮下注射6～8点，每点0.1～0.2ml，也可肌肉内或皮内注射，对家兔进行免疫。一共三次，