四步法消除SYBRGreen_实时定量RT_PCR中引物二聚体的影响.pdf

ISSN 中国生物化学与分子生物学报 2004 年 6 月 ( ) CN 　113870Q Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology 20 3 :387～392 ·技术与方法 · 四步法消除 SY BR Green Ⅰ实时定量 RTPCR 中 引物二聚体的影响 张驰宇1 ,2) , 　张高红1 ,2) , 　杨 　敏1) , 　贲昆龙1) ( 1) 2) ) 中国科学院昆明动物研究所分子与细胞免疫学实验室 , 昆明　650223 ; 中国科学院研究生院 ,北京 　100039 ( ) 摘要 　为建立一种新的 SYBR green Ⅰ实时定量 RTPCR 方法 ,使之能够有效消除引物二聚体 PDs 对实时定量结果的影响. 对 RTPCR 特异性扩增产物和 PDs 分别进行了凝胶电泳检测和熔解曲线 ( ) 分析. 依据 PDs 和扩增产物的熔解温度 T 特点 ,在通用的三步法的延伸步骤之后 ,增加一个短暂 m ( ) 的 5 s 恒温和荧光检测步骤 ,使这个步骤的温度高于 PDs 的 T ,但低于扩增产物的 T ,简称该法 m m 为四步法. PDs 的 T 通常高于 72 ℃,但低于扩增产物的 T . 将四步法第四步的温度设置在高于 m m PDs 的 T ,但低于扩增产物的 T 时 , 四步法能够有效地消除 PDs 的影响. 对三步法和四步法 SYBR m m green Ⅰ实时定量 RTPCR 进行了比较 ,发现三步法根本不能用于 RNA 的实时定量 ,而四步法能够实 现包括低丰度 RNA 在内的RNA 的定量. 选择 T 值尽可能小的引物 ,使 PDs 与扩增产物 T 值之间