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Polymerase chain reaction N2 以聚合連鎖反應增殖DNA 王 愛 玉 Polymerase chain reaction (PCR) 是試管中合成DNA 的方法，可以在短短幾個 小時內將目標基因大量增殖出 。PCR 技術的發展使得基因的選殖與增殖無需經由生 物細胞的複製系統，目前已成為分子生物學常用之方法。本實驗將以N1 得到的大腸 桿菌染色體DNA 為材料，以PCR 進行 -galactosidase 基因 (lacZ) 的增殖，藉以體 認此方法之原理及效率 。。 2.1 背景知識 2.1.1 DNA polymerase 與DNA 複製 在細胞中，DNA 的複製是藉由一套複雜的酵素系統來完成，其中的主角 為 DNA polymerase ，此酵素負責催化核酸的聚合，合成與原先DNA 具有互 補序列的DNA 。原核及真核細胞中的DNA polymerase 都不止一種，有些專司 DNA 複製 ，有些則參與DNA 的修補，但在催化DNA 合成的反應上都具有一 些共同的特性 ：1) 需要有模版 (template) DNA 的存在 ；2) 需要有一段與模 版DNA 序列互補的單股DNA 或RNA （稱為引子 ，primer ），先黏合在模版 DNA 上 ；3) 核酸的聚合是由引子的 3’-OH 端開始延伸 （稱為 primer extension ），以5’3’的方向進行DNA 合成 。4) 需要Mg2+ 作為cofactor 。 此外 ，許多 DNA polymerase 除了具有polymerase 的活性外 ，還具有 3’5’ exonuclease 的活性 ，可以將聚合錯誤的核酸去除 （此功能稱為 proofreading ），以維持DNA 複製的正確性 。有些polymerase 也具有 5’3’ exonuclease 的活性 ，用於水解引子序列或參與DNA 修補等 。 DNA 的合成也可以在試管中進行，只要提供模版DNA 、引子、核酸 、 含有 Mg2+ 的反應緩衝液 ，DNA polymerase 即可催化核酸聚合反應的進 行。目前在分子生物研究上常用的一些實驗 ，例如 ：核酸定序、放射線核酸 探針的合成、第二股cDNA 的合成、雙股DNA 末端的修補…等等 ，都是利用 DNA polymerase 來進行primer extension 反應 。本實驗用的PCR 也是試管中 合成DNA 的方法 ，可用於DNA 大量增殖 。 2.1.2 RCR 原理及發展 在試管中進行DNA 增殖的概念最早是由Ghobind Khorana 等人於1971 年提出 生物化學實驗 N2-1 以聚合連鎖反應增殖DNA 的 ：含有雙股 DNA 的溶液中 ，若同時有一對引子存在 （引子的序列與雙股 DNA 的部分序列互補 ，且其量超過雙股DNA 的量），當加熱使雙股DNA 打 開為單股後，繼而使溫度下降至適當溫度時，每一條引子將有機會黏合至與其 序列互補的單股DNA 上。此時若加入DNA polymerase ，此酵素即可進行聚合 反應 ，原雙股DNA 也因此可被複製為兩倍 。新合成的DNA 可繼續做為下一 回合反應的模版，只要反覆經過加熱變性、降溫及添加新鮮的DNA polymerase