表达H9N2禽流感病毒NP蛋白的巨型艾美耳球虫转染载体的构建及体外转染.doc

  表达 H9N2 禽流感病毒 NP 蛋白的巨型艾美 耳球虫转染载体的构建及体外转染# 李媛，殷光文，谢丽，索静霞，刘贤勇，索勋** （中国农业大学动物医学院，北京 100193） 摘要：目的：构建表达禽流感 NP 蛋白的鸡巨型艾美耳球虫双框载体并验证其功能。方法： 从禽流感病毒（H9N2 北京株）中扩增得到 NP 基因，在本实验室已构建好的表达红绿荧光 蛋白的双框载 pMEAAssRA 基础上，采用 Age I，Not I 进行双酶切，用 NP 基因片断取代红 荧光基因片断，得到表达 NP 蛋白的 pMEAAssNPmA 双框载体。将构建好的质粒经核穿孔 方法转染巨型艾美耳球虫子孢子，并在 MDBK 细胞中进行培养。结果：经酶切和 PCR 鉴定 及 DNA 测序，确认表达 NP 蛋白的双框载体构建完全正确。核转 24h 后可在荧光显微镜下 观察到表达荧光的子孢子。结论：成功构建表达 NP 蛋白的球虫转染载体，为下一步表达 NP 抗原的转基因巨型艾美耳球虫的构建奠定了基础。 关键词：NP 蛋白；双框载体；巨型艾美耳球虫；体外转染 Construction of transfection vector expressing AIV nucleoprotein and its transient expression in Eimeria maxima LI Yuan, YIN Guangwen, XIE Li, SUO Jingxia, LIU Xianyong, SUO Xun (College of Veterinary Medicine,China Agricultural University, Beijing 100193) Abstract: Objective: Construct transfection vector expressing H9N2 avian influenza virus nucleoprotein by a double-cassette expression vector strategy. Method: The NP gene amplified from H9N2 virus (Beijing strain) was cloned into Age I and Not I digested pMEAAssRA vector, generating the pMEAAssNPmA plasmid. Then the linearized vector was transfected into the sporozoites of Eimeria maxima via Nucleofector transfection. Results: The double-cassette expression vector was sucessfully constructed and sporozoites expressing yellow fluorescent protein were observed. Conclusion: NP gene from the H9N2 virus can be expressed by E. maxima, encouraging the development of transgenic E. maxima expressing genes from influenza virus. Keywords: NP protein; double-cassette vector; Eimeria maxima; transient expression 0 引言 核蛋白 (Nucleoprotein，NP) 是禽流感病毒核衣壳蛋白的主要结构蛋白，分子量约为 69 [1] 具有型特异性。NP 蛋白、尤其是其 N 端，在各个亚型的禽流感病毒之间高度保守[2]。NP 具有很强的免疫原性，能够激发宿主产生保护性的细胞免疫应答。由于 NP 抗原的保守性使 得这种 NP 特异性的细胞免疫应答具有交叉保护作用，科学家由此希望研发含有 NP 抗原组 份的禽流感通用疫苗[3]。 经口免疫后，鸡球虫病活卵囊疫苗可以激发鸡群产生完全的抗球虫保护，以此为基础的 球虫病活卵囊疫苗在世界范围内得到广泛应用，为鸡球虫病的防控做出了巨大贡献[4]。本实 验室基于球虫病活卵囊疫苗的高效性和安全性，尝试建立表达外源抗原的转基因球虫活载体 疫苗，从而在防治球虫病的同时防治鸡的其它传染性疾病。本研究构建了表达禽流感病毒 NP 抗原的转基因巨型艾美耳球虫（Eimeria maxima）表达载体，为后续工作奠定基础。 基金项目：2010 年度高等学校博士学科点专项科研基金（201000081