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第三节 酶的分离纯化 酶的提取(抽提)是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。 酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。 四 酶的分离方法 （四） 层析分离 层析法的基本原理 利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在流动相和固定相中的分布程度不同，并以不同的速度移动而达到分离的目的。 mobile phase：携带样品流过整个系统的流体 stationary phase：静止不动的一相 层析法的分类 流动相有两种状态： *液体作为流动相 *气体作为流动相 固定相也有两种状态： *固体吸附剂作为固定相 *以吸附在固体上的液体作为固定相 按两相所处的状态分类： 液相层析 液-固层析 液-液层析 气相层析 气-固层析 气-液层析 五 酶的组合分离纯化策略 六 酶的浓缩、干燥与结晶 七 酶的保存 1.温度 酶的保存温度一般在0～4℃，但有些酶在低温下反而容易失活，因为在低温下亚基间的疏水作用减弱会引起酶的解离。此外，零度以下溶质的冰晶化还可能引起盐分的浓缩，导致溶液的pH发生改变，从而可能引起酶巯基间连接成为二硫键，损坏酶的活性中心，并使酶变性。 七 酶的保存 4.蛋白质的浓度及纯度 一般地说，酶的浓度越高，酶越稳定，制备成晶体或干粉更有利于保存，可通过加入酶的各种稳定剂如底物、辅酶、无机离子等来加强酶稳定性，延长酶的保存时间。 思考题 1 酶的提取与分离纯化技术路线 2细胞破碎的方法及其原理 3 酶的提取的方法有哪些 4 酶的分离方法有哪些 5 酶的浓缩、干燥与结晶 层析法也称色谱法，是1903年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。将植物色素溶液通过装有CaCO3 吸附剂的柱子，然后用石油醚淋洗，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开。 使溶液中的溶质由液相转变为固相析出 古老、实用、简单的初步分离方法 凝胶层析又称为凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析等。是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。 （4）凝胶层析 凝胶层析柱中装有多孔凝胶，当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较小的分子能进入凝胶的微 孔内，不断地进出于颗粒的微孔内外，这就使小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。 （4）凝胶层析 常用的凝胶：葡聚糖凝胶、琼脂凝胶与琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶 类型 工作范围（相对分子质量） 床体积/（ml/g干胶） 葡聚糖凝胶 Sephadex G-10 200 2～3 G-15 150 2.5～3.5 G-25 1 000～6 000 4～6 G-50 1500～30 000 9～11 G-75 30 000～70 000 12～15 G-100 4 000～150 000 15～30