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Chapter 7 细胞培养 源起 单细胞获得 悬浮培养 单细胞培养 应用 一、概述： 1、细胞培养：人工培养从植物或培养物上游离的细胞或小细胞团的实验方法。 大量培养 悬浮培养：生产 个体培养 单cell培养：科研、改良 ★细胞密度：单位体积内的细胞数量，是影响细胞培养的关键技术环节。 2、意义： 1）、单cell 全能性 1965 Vasil 2）、植物细胞生产（生物反应器）：次生代谢产物，人工种子； 3）、遗传转化受体：单细胞、原生质体； 4）、筛选突变体：遗传改良； 应用：药品、食品生产，科研etc. 二、单细胞或小细胞团的获得： 1）、机械分离：小规模实验及生产适用。 2）、酶解法：果胶酶 分离单细胞 纤维素酶 破壁 （ 必须对细胞进行渗透压保护，对某些种类不适用 ：eg 小麦、大麦、玉米etc.） 3）、由callus获得：结构松散的callus经振荡 培养，可得到游离的细胞。 ★ 由组织培养物获得：获得均一、松散的 （callus） 适合悬浮培养的愈 伤组织。 培养基 外植体 高水平IAA，2,4-D 取材原则：生活力强 三、悬浮培养：将游离细胞或细胞团按一定密度，悬浮在液体培养基中不断地搅拌或振荡培养，使培养细胞快速、大量增殖。 分批培养 1、方法 连续培养 半连续培养 例：分批培养： I、建立callus ：获得均一、松散 callus； II、建立悬浮系：培养方法， （摇瓶培养） 增殖规律； III、悬浮系增殖：细胞批量增殖 或获得次生产物 1、生长曲线：S曲线 2、继代：①保持对 数期； ②缩短滞 后期。 ☆滞后期长短： ①细胞生长时期： 对数期、直线期 ②细胞密度： 1万～10万 个/ml 悬浮系增殖的技术难点：通气、剪切力适应 性；细胞同步化； ①培养：培养基：BM+CYT/IAA； 培养条件：T，O2，PH，r（转速） ②同步化：理想悬浮系 ③细胞增殖的监测：适时测定细胞数量，掌 握放罐时机。 同步化处理方法： ①饥饿法：进行分离必须营养物质限制 ②抑制法：化学试剂；eg氨基脲嘧啶 ③低温处理 ④分级培养：流式细胞仪 测定悬浮系细胞数量的方法： ①细胞计数：血球计数板计数; ②干重，鲜重测定； ③PVC 细胞密实体积; 取样 离心 测定固体物体积 （水平转头） （ml/ml） ④细胞活力测定：FDA、依凡镁兰； 相差显微镜镜检。 2、培养基：与培养的细胞密度相关 1）、高密度悬浮系 : 5X10 个/ml ①用B5，ER等专用培养基； ②对传统培养基作出改良 能