生物化工与环境工程专业毕业论文--根癌农杆菌介导转化AtNHX1基因甘蓝型油菜的研究.docVIP

根癌农杆菌介导AtNHX1基因转化甘蓝型油菜的研究 摘 要 以甘蓝型油菜带柄子叶为转化受体，通过根癌农杆菌介导法，将Na+/H+逆向转运蛋白AtNHX1基因转入甘蓝型油菜中。结果表明，外植体经浓度OD600为0.4的菌液中侵染8-10min，卡那抗性绿苗率达3.75℅，经过对抗性植株的PCR检测证明外源基因已经整合到油菜基因组中，为提高甘蓝型油菜的耐盐能力提供了新的途径。 关键词：根癌农杆菌；带柄子叶；卡那霉素；转基因甘蓝型油菜； Research of AtNHX1 Gene transformation in Brassica napus by Agrobacterium tumefaciens Abstract Chosen cotyledon petiole as the recipient for transformation. AtNHX1 gene was transferred into Brassica napus by Agrobacterium tumefaciens transferring system. The results showed that the best physiological and transforming condition was in OD600 0.4 liquid bacterium for 8-10 min, 3.75℅ kan-resistant green seedings were obtained. It was proved that NHX gene was inserted into the genome of oilseed by the methods of PCR.It could provide a new way to improve the salt tolerance about Brassica napus. Keywords：Transgenic Brassica napus; 目 录 引 言 4 1 实验材料 5 1.1 植物材料 5 1.2 菌种及质粒 5 1.3 抗生素 5 1.4 培养基的种类 5 1.4.1植物培养基 5 1.4.2细菌培养基 5 1.5 农杆菌菌液的制备 6 2 实验方法 6 2.1 无菌苗的培养 6 2.2 油菜基因型的筛选 6 2.1.2预培养 6 2.1.3分化培养 6 2.1.4继代培养 6 2.1.5生根培养 6 2.1.6再生苗的移出 6 2.3 植物表达载体PX6- AtNHX1转化甘蓝型油菜 6 2.3.1预培养 6 2.3.2外植体的侵染 7 2.3.3共培养 7 2.3.4筛选培养 7 2.3.5继代培养 7 2.3.6抗性苗的获得 7 2.3.7生根培养 7 2.4 转基因植株的检测 7 2.4.1甘蓝型油菜DNA的提取 7 2.4.2PCR基因扩增 8 2.4.3基因条带的检测 9 3 实验结果 9 3.1 不同基因型对甘蓝型油菜外植体分化率的影响 9 3.2 芽苗的生根培养 10 3.3 再生苗的移出 11 3.4 植物表达载体PX6- AtNHX1转化得到的油菜 12 3.5 芽增殖的培养 14 3.6 转基因甘蓝型油菜的检测结果 14 4 讨论 15 参考文献： 17 致 谢 18 引 言 土壤盐渍化对农业的威胁是一个全球性问题，土壤盐渍化严重影响着农业的产量，尤其是使灌溉农业作物减产。同时盐分过高还可使土壤盐渍化，限制土壤的利用。目前，世界上大约20%的耕种土地和接近一半的灌溉土地都遭到了盐胁迫的危害[1]。高盐环境是影响植物生长和发育的主要环境因子之一。分子生物学的发展，使人们能够在基因组成、表达调控及信号传导等分子水平上认识植物对盐逆境胁迫的耐(抗) 性机理，从而通过基因工程手段改良植物耐(抗) 盐性。 随着分子遗传学和植物转基因技术的快速发展，采用生物技术提高作物的耐盐性，使作物在盐胁迫环境中能够正常生长并提高产量，正受到越来越多的关注，并取得了一定的成果。提高作物耐盐性的方法有很多，如改造生物合成途径，在作物体内表达耐盐相关基因或改变基因对胁迫的反应特性等[2-3]。 NHX（Na+/H+ antiporter）为液泡膜中的一种Na+/H+反向运输体[4]，可促进离子在液泡中的分室效应，同时还可减少细胞毒性。在转基因拟南芥和转基因西红柿中过量表达AtNHX1，可在液泡膜中积累大量的运输体，并且极大地提高了它们的耐盐性[5,6]。这些结果显示出AtNHX 家族在钠离子的液泡分室效应中起着关键的作用。 油菜是我国主要的油料作物之一，随着农业生物技术的发展，人们越来越重视基因工程技术改良油菜品种，成功的基因转化主要依赖于良好的植物受体系统的建立。从整体上看，