基因芯片的操作流程及步骤.ppt

基因芯片结构示意图 生物芯片的制作步骤 简介 基因芯片 探针固相原位合成技术与照相平板印刷技术 激光共聚焦显微技术 中科院遗传所人类基因组中心 北京大学 联合基因集团有限公司 我国第一家批量生产基因 芯片 拥有近2千条基因药物发明专利 东南大学吴健雄实验室 中科院计算所生物信息学实验室 上海生科院 我国基因芯片的研究现状 目前，我国尚未有较成型的基因芯片问世，但据悉已有几家单位组织人力物力从事该技术的研制工作，并取得了一些可喜的进展。标志着我国相关学科与技术正在走向成熟。 涉及领域：生命科学、计算机科学、精密机械科学 生物芯片分类 根据用途还可以把生物芯片分为两类：信息生物芯片（information-biochip）和功能生物芯片（function-biochip）。 基因芯片（gene chip）的原理 基因芯片的测序原理是杂交测序法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法。在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置 ，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶序列的核酸。 基因芯片又称DNA微阵列（DNAmicroarray） 三种主要类型： 1）固定在聚合物基片（尼龙膜、硝酸纤维膜等）表面上的核酸探针或cDNA片段——通过同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测 2）用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列——通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测 3）在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列——与荧光标记的靶基因杂交进行检测 主要类型 多种方法将寡核苷酸或短肽 固定到固相支持物上 原位合成（in situ synthesis） 合成点样 支持物：玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等 基因芯片 /DNA 微阵列Gene Chip /DNA Microarray 2.基因芯片的基本原理分析 任何线状的单链DNA或RNA序列均可被分解为一个序列固定、错落而重叠的寡核苷酸，又称亚序列（subsequence）。例如可把寡核苷酸序列TTAGCTCATATG分解成5个8 nt亚序列： 这5个亚序列依次错开一个碱基而重叠7个碱基。 亚序列中A、T、C、G 4个碱基自由组合而形成的所有可能的序列共有65536种。 假如只考虑完全互补的杂交，那么48个8 nt亚序列探针中，仅有上述5个能同靶DNA杂交。 可以用人工合成的已知序列的所有可能的n体寡核苷酸探针与一个未知的荧光标记DNA/RNA序列杂交，通过对杂交荧光信号检测，检出所有能与靶DNA杂交的寡核苷酸，从而推出靶DNA中的所有8 nt亚序列，最后由计算机对大量荧光信号的谱型（pattern）数据进行分析，重构靶DNA 的互补寡核苷酸序列。 原理 -- 通过杂交检测信息 二、 基因芯片基本操作流程 制备总RNA→ mRNA经RT--PCR用Cy3（正常对照组）和Cy5（实验组）荧光标记目的基因，得到cDNA 探针→ 混合标记探针→与表达谱芯片上核苷酸片段（或基因）杂交→扫描→分析杂交结果→结论 载体+寡核苷酸-探针分子+荧光染料-点样仪-扫描仪-计算机+专业软件 基因芯片流程（一） 1. 实验设计 2. 样品制备（指mRNA或总RNA样品，包括对照组和实验组。将mRNA或总RNA分别进行逆转录生成cDNA，然后将对照组和实验组cDNA分别标记Cy3和Cy5荧光信号） 3. 芯片制备（寡核苷酸探针或 cDNA探针，包括PCR，纯化，点样等步骤） 基因芯片流程（二） 4. 芯片杂交（将用Cy3和Cy5荧光标记的对照组和实验组的cDNA 等量混合，与芯片进行杂交） 5. 芯片扫描（采用激光扫描仪，分别用532nm和635nm波长激光扫描芯片，对于每张芯片，得到Cy3和Cy5通道两幅图象） 基因芯片流程（三） 6.. 图象处理（采用专门软件，对图象进行分析，提取每个点上的数字信号，得到原始数据表） 7. 数据校正和筛选（对Cy5或Cy3信号进行校正，消除实验或扫描等各环节因素对数据的影响，同时利用筛选规则对数据中的“坏点”，“小点”，“低信号点”进行筛选，并作标记） 基因芯片流程（四） 8. 目的基因或序列的确定（采用ratio值对差异基因进行判断，或采用统计方法如线性回归、主成分分析、调整P值算法等对差异基因进行统计推断） 9. 生物信息学分析（如cluster 算法、差异基因的同源性比对，差异基因的相关文献检索等） 微流控芯片检测仪 基因芯片的阅读分析系统 芯片扫描仪 芯片杂交盒 三、 基因芯片设计步骤 1. 基因芯片设计的一般性原则 基因芯片设计主要包括两个方面: 探针的设