基因芯片的操作流程及步骤.ppt

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基因芯片结构示意图 生物芯片的制作步骤 简介 基因芯片 探针固相原位合成技术与照相平板印刷技术 激光共聚焦显微技术 中科院遗传所人类基因组中心 北京大学 联合基因集团有限公司 我国第一家批量生产基因 芯片 拥有近2千条基因药物发明专利 东南大学吴健雄实验室 中科院计算所生物信息学实验室 上海生科院 我国基因芯片的研究现状 目前,我国尚未有较成型的基因芯片问世,但据悉已有几家单位组织人力物力从事该技术的研制工作,并取得了一些可喜的进展。标志着我国相关学科与技术正在走向成熟。 涉及领域:生命科学、计算机科学、精密机械科学 生物芯片分类 根据用途还可以把生物芯片分为两类:信息生物芯片(information-biochip)和功能生物芯片(function-biochip)。 基因芯片(gene chip)的原理 基因芯片的测序原理是杂交测序法,即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法。在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG,与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时,通过确定荧光强度最强的探针位置 ,获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶序列的核酸。 基因芯片又称DNA微阵列(DNAmicroarray) 三种主要类型: 1)固定在聚合物基片(尼龙膜、硝酸纤维膜等)表面上的核酸探针或cDNA片段——通过同位素标记的靶基因与其杂交,通过放射显影技术进行检测 2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列——通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测 3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列——与荧光标记的靶基因杂交进行检测 主要类型 多种方法将寡核苷酸或短肽 固定到固相支持物上 原位合成(in situ synthesis) 合成点样 支持物:玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等 基因芯片 /DNA 微阵列 Gene Chip /DNA Microarray 2.基因芯片的基本原理分析 任何线状的单链DNA或RNA序列均可被分解为一个序列固定、错落而重叠的寡核苷酸,又称亚序列(subsequence)。例如可把寡核苷酸序列TTAGCTCATATG分解成5个8 nt亚序列: 这5个亚序列依次错开一个碱基而重叠7个碱基。 亚序列中A、T、C、G 4个碱基自由组合而形成的所有可能的序列共有65536种。 假如只考虑完全互补的杂交,那么48个8 nt亚序列探针中,仅有上述5个能同靶DNA杂交。 可以用人工合成的已知序列的所有可能的n体寡核苷酸探针与一个未知的荧光标记DNA/RNA序列杂交,通过对杂交荧光信号检测,检出所有能与靶DNA杂交的寡核苷酸,从而推出靶DNA中的所有8 nt亚序列,最后由计算机对大量荧光信号的谱型(pattern)数据进行分析,重构靶DNA 的互补寡核苷酸序列。 原理 -- 通过杂交检测信息 二、 基因芯片基本操作流程 制备总RNA→ mRNA经RT--PCR用Cy3(正常对照组)和Cy5(实验组)荧光标记目的基因,得到cDNA 探针→ 混合标记探针→与表达谱芯片上核苷酸片段(或基因)杂交→扫描→分析杂交结果→结论 载体+寡核苷酸-探针分子+荧光染料-点样仪-扫描仪-计算机+专业软件 基因芯片流程(一) 1. 实验设计 2. 样品制备(指mRNA或总RNA样品,包括对照组和实验组。将mRNA或总RNA分别进行逆转录生成cDNA,然后将对照组和实验组cDNA分别标记Cy3和Cy5荧光信号) 3. 芯片制备(寡核苷酸探针或 cDNA探针,包括PCR,纯化,点样等步骤) 基因芯片流程(二) 4. 芯片杂交(将用Cy3和Cy5荧光标记的对照组和实验组的cDNA 等量混合,与芯片进行杂交) 5. 芯片扫描(采用激光扫描仪,分别用532nm和635nm波长激光扫描芯片,对于每张芯片,得到Cy3和Cy5通道两幅图象) 基因芯片流程(三) 6.. 图象处理(采用专门软件,对图象进行分析,提取每个点上的数字信号,得到原始数据表) 7. 数据校正和筛选(对Cy5或Cy3信号进行校正,消除实验或扫描等各环节因素对数据的影响,同时利用筛选规则对数据中的“坏点”,“小点”,“低信号点”进行筛选,并作标记) 基因芯片流程(四) 8. 目的基因或序列的确定(采用ratio值对差异基因进行判断,或采用统计方法如线性回归、主成分分析、调整P值算法等对差异基因进行统计推断) 9. 生物信息学分析(如cluster 算法、差异基因的同源性比对,差异基因的相关文献检索等) 微流控芯片检测仪 基因芯片的阅读分析系统 芯片扫描仪 芯片杂交盒 三、 基因芯片设计步骤 1. 基因芯片设计的一般性原则 基因芯片设计主要包括两个方面: 探针的设

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