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植物体细胞杂交技术 植物体细胞杂交的意义 有性杂交是植物遗传改良的一种传统手段。 作用空间：主要限于种内的品种之间。 种及种以上分类单位之间的杂交，例如种间或属间杂交，则常常遭遇有性不亲和性障碍。 体细胞杂交（somatic hybridization): 在离体条件下通过两个亲本体细胞原生质体的融合以及随后将融合产物培养成杂种植株的过程。 1972年，Carlson首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种，这也是第一个植物体细胞杂种。 1978年梅尔彻斯(Melchers)等首次获得了番茄和马铃薯的属间体细胞杂种——“Potamato”。 体细胞杂交步骤： 1 原生质体的制备 2 原生质体的融合 3 杂种细胞选择 4 杂种细胞培养 5 由愈伤组织再生植株 6 杂种植株的鉴定 2 原生质体融合 2.1自发融合 在酶解细胞壁的过程中，有些相邻的原生质体能彼此融合形成同核体(homokaryon)，每个同核体包含2～40个核。 形成的原因：由不同细胞间胞间连丝的扩展和粘连造成的。 减少自发融合的措施：在用酶液处理之前，使细胞受到强烈的质壁分离药物的作用，切断胞间连丝。 原生质体融合 1自发融合 2 诱发融合 1 NaNO3处理 2 高PH-高浓度钙离子处理 3 PEG（聚乙二醇）处理 4 电融合 2 原生质体融合 2.2 诱发融合 2.2.1 NaNO3处理 1909年，Kuster在一个发生了质壁分离的表皮细胞中，低渗NaNO3溶液可以引起2个亚原生质体的融合。 缺点：异核体(heterokaryon)形成频率不高。 2 原生质体融合 高PH-高浓度钙离子处理 1973年，Keller和Melchers，用强碱性(PH10.5)的高浓度钙离子（50mmol.L-1)溶液在37℃下处理约30min，两个品系的烟草叶肉原生质体很容易融合。 但对于有些原生质体系统，这样高的PH值是有毒的。 2 原生质体融合 PEG(聚乙二醇)处理 PEG作为融合剂的优点: ①异核体形成的频率高，可重复性强，对大多数细胞低毒； ②形成双核异核体的频率高。 2 原生质体融合 PEG(聚乙二醇)处理 据Burgess和Flenming（1974年）报道： 在37℃下用高钙离子的强碱性溶液处理时，产生的聚集体 很大，每个包含很大原生质体。 以PEG为融合剂时，多数聚集体包含2～3个原生质体。 2 原生质体融合 PEG(聚乙二醇)处理 PEG的作用机理： Kao等认为，由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在原生质体之间形成分子桥，其结果是使原生质体发生粘连进而促使原生质体的融合。 另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。 2 原生质体融合 PEG (聚乙二醇)处理 融合基本过程 2 原生质体融合 PEG(聚乙二醇)处理 注意事项： ①PEG的分子量 （MW 1500～6000） ②酶溶液浓度 ③原生质体来源 ④PEG的稀释逐步进行 ⑤在PEG溶液中，加入钙离子可以提高融合效率） 2 .原生质体融合 PEG(聚乙二醇)处理 ⑥高温（35～37℃） ⑦4%～5%（V/V）的原生质体悬浮液 ⑧所用酶种类和浓度，一般用崩溃酶。 ⑨材料预培养 ⑩融合地点（在离心管中，在小液滴中） ⑾ 在PEG溶液中的保温时间太长会降低异核体形成频率。 2 原生质体融合 电融合 将一定密度的原生质体悬浮液置于一个融合小室中，小室两端有电极，在不均匀的交变电场的作用下，原生质体彼此靠近，在两个电极间排列成串珠状。这时，如果有足够强度的电脉冲，就可以使质膜发生可逆性电击穿，从而导致融合。 细胞电融合仪 融合产物的细胞学 在膜融合以后的数小时内，2个细胞的细胞质混在一起，形成一个双核异核体。