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高效液相色谱 （high performance liquid chromatography,HPLC） 中南大学湘雅医学院医学检验系 徐克前 一　基本原理（一）定义 HPLC 是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同，进行连续的、无数次的交换和分配而达到分离的过程。 组成： 固定相—柱内填料 流动相—洗脱剂 （二）固定相（stationary phase)和 流动相（mobile phase） 键合相反应 R1 | | | | –Si –OH + X–Si–R ? –Si –O–Si–R + HX | | | | R2 硅胶 有机硅烷 键合相 X: Cl、CH3O、C2H5O等 R: 烷C8(C8H17) 、C10(C10H21) 、C18(C18H37)等 R1 R2: Z、CH3等  (2)十八烷基硅烷键合硅胶填充料（octadecylsilyl, ODS）—万能柱 即C18柱或ODS柱 主要用于反相HPLC中，适用于各种类型的生物分子 (4)键合到基质上的官能团性质 反相柱：填料是非极性的，官能团为烷烃，如 C18 、C8 、C4等 正相柱：填料是极性的，官能团为－CN、－NH2等 离子交换键合相：阳离子官能团：－SO3H、 2、流动相 （mobile　phase） 流动相选择原则：　 1.样品易污，且溶解度尽可能大2.化学性质稳定，不损坏柱3.不妨碍检测器检测分析4.粘度低，流动性好5.易于从中回收样品6.无毒或低毒，易于操作7.易于制成高纯度，即色谱纯8.废液易处理，不污染环境 二、分离模式 正相HPLC 反相HPLC 离子交换HPLC 凝胶HPLC 亲和HPLC （一）正相HPLC（normal phase HPLC ,NP- HPLC ） 固定相：极性吸附剂（或极性键合　　　　　　　　　　 相），如硅胶、Al3O2 流动相：非极性或弱极性溶剂，如己烷、 庚烷等 洗脱顺序：非极性、弱极性、极性 应用：石油化工产品、染料、农药、医 药、有机酸、有机碱等 （二）反相HPLC（reverse phase HPLC ,RP- HPLC ） 固定相：非极性物质，如C18(ODS)、 　　　C10、C8 、C6 、C4 、C2 流动相：极性溶剂，如甲醇/H2O、乙腈/H2O等 洗脱顺序：极性、弱极性、非极性 应用：蛋白质、多肽等 （三）离子交换HPLC（ion-exchange HPLC ,IE- HPLC ） 原理：用离子交换剂作固定相，根据不同组分在一定pH下，组分电荷性质和数量不同而分离的技术 分类：阳离子交换树脂：含酸性基团： （四）凝胶HPLC （gel HPLC ,G- HPLC ） 原理：基于分子大小和形状的差异进行分析的技术 固定相：交联葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶 流动相：水、乙醇、丙酮等 应用：核酸、蛋白质、酶、多糖等 （五）亲和HPLC（affinity HPLC ,AF- HPLC ） 原理：利用生物大分子间专一的亲和力　 进行分离的技术 固定相：基质（琼脂糖凝胶等）交联配 基（亲和性） 应用：酶、抗体、抗原、受体等 （一）输液系统： 贮液及脱气装置 梯度洗脱装置 高压输液泵 （二）进样系统： 高效液相色谱仪器（2） 高效液相色谱仪器（3） 高效液相色谱仪器（4） 四、定性和定量 定量分析 分析检测物质的量（或浓度）与检测器的响应值（峰面积或峰高）呈正比 1.标准曲线法：也称外标法或直接比较法。用标准品等体积直接进样，得标准曲线，再用待测样品的峰面积（或峰高）与其对照 2.内标法：选择适宜的物质作为欲测组分的内标物加入到样品中，内标物的选择是关键 3.标准加入法：以欲测组分的纯物质作内标物加入到待测样品中 五、临床应用 2.荧光检测器 4.示差折光检测器 表.HLPC常用检测器 检测器 原理 检测下限（g/ml） 检测范围 紫外检测器 具有紫外吸收性质 1