表达TLR4小RNA腺病毒对脂多糖诱导急性肺损伤大鼠的保护作用.docVIP

表达TLR4小RNA腺病毒对脂多糖诱导急性肺损伤大鼠的保护作用 摘要： 目的 构建表达大鼠TLR4 siRNA的腺病毒，并观察对体外培养大鼠肺泡巨噬细胞TLR4的抑制及对体内脂多糖诱导急性肺损伤大鼠的保护作用。方法 采用基因工程的方法构建含TLR4基因的报告载体pEGFPC1-TLR4，化学合成3对发卡样的双链寡核苷酸并克隆入pShuttleH1载体，构建3个表达TLR4小的RNA的质粒pShuttleH1-siTLR4。将3个pShuttleH1-siTLR4与报告载体pEGFPC1-TLR4共转染HEK293细胞，通过荧光显微镜及流式细胞术观察荧光的强弱，以HEK293细胞中报告载体荧光表达的强弱筛选出高效的小干扰RNA。将筛选出的干扰效率最高的pShuttleH1-siTLR4线性化后电转化到含pAdEasy-1的BJ5183感受态细菌中重组质粒重组质粒α、IL-1β的释放情况。SD大鼠随机分为Control组、Ad-siTLR4组和Ad-EGFP组。Ad-siTLR4组，先经气管内滴入腺病毒Ad-siTLR4，7d后尾静脉注射LPS 5mg／kg；Ad-EGFP组，先经气管内滴入腺病毒Ad-EGFP，7d后尾静脉注射LPS 5mg／kg；Control组，先经气管内滴入生理盐水（normal saline），7d后尾静脉注射生理盐水。尾静脉注射后进4h行双肺灌洗，将肺泡灌洗液离心，上清吸出待ELISA检测TNF-α、IL-1β，同时检测MPO活性、BALF的蛋白浓度及肺组织测定肺湿／干重比。光镜下观察肺组织形态学变化，并采用免疫荧光、实时荧光定量PCR观察TLR4蛋白及mRNA的表达。结果 筛选出高效抑制大鼠的TLR4的小RNA，并成功克隆入重组腺病毒。在体外细胞实验中，内毒素可诱导肺泡巨噬细胞TLR4蛋白和mRNA水平的上调，TNF-α、IL-1β的表达均明显升高。转染腺病毒后，Ad-siTLR4组内毒素诱导的肺泡巨噬细胞TLR4蛋白和mRNA水平较Ad-EGFP组明显下降，TNF-α、IL-1β的表达均减弱。在大鼠在体实验中，腺病毒Ad-siTLR4处理组，肺组织结构明显改善，渗出的蛋白减少；肺湿／干重比、MPO的活性下降，肺组织TLR4 及TNF-α、IL-1β蛋白水平较Ad-EGFP组明显下降。结论　成功构建表达大鼠TLR4 siRNA的腺病毒，具有良好的抑制TLR4和TNF-α、IL-1β的作用，可降低内毒素所致急性肺损伤肺泡毛细血管膜的通透性，使肺组织病理损伤减轻，可能为基因治疗急性肺损伤提供新的方法。 关键词：Toll样受体4；RNA干扰；腺病毒；TNF-α；IL-1β；急性肺损伤；MPO Protective effect of adenovirus expressing TLR4 siRNA on rats acute lung injury induced by LPS Wu Fei-xiang, lv xin, Miao Xue-rong, Ge Yan-hu, Sun Yu-ming,Yang Li-qun, Xu Xue-wu, YU Wei-feng (Department of Anesthesiology, Eastern Hepatobiliary Hospital,Second Medical Military University, Shanghai 200438) Abstract: Objective　To construct the incompetent-replication adenovirus expressing TLR4 siRNA and to identify suppression effect on tlr4 in LPS-induced macrophage in vitro and protective effect on acute lung injury induced by LPS in vivo. Methods　 Sequences of TLR4 were obtained by RT-PCR and inserted into pEGFPC1 to construct reporter vector pEGFPC1-TLR4. Three different complementary DNAs containing both sense and antisense Oligo DNA of the targeting sequence were cloned into the pShuttleH1 vector to obtain three plasmids pShuttleH1-siTLR4．pShuttleH1-siTLR