实验2血清（蛋清）蛋白的醋酸纤维薄膜电泳.pptVIP

实验二 一 实 验 目 的 二 实 验 原 理 电泳是利用不同带电质点在同一电场中泳动速度不同分离物质的方法。醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法。 二 实 验 原 理 二 实 验 原 理 二 实 验 原 理 二 实 验 原 理 二 实 验 原 理 三 操 作 步 骤 三 操 作 步 骤 三 操 作 步 骤 三 操 作 步 骤 三 操 作 步 骤 三 操 作 步 骤 四 实验结果 五 注意事项 六 思 考 题 生 物 化 学 实 验 血清（蛋清）蛋白的 醋酸纤维薄膜电泳 学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳的一般原理。 带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。蛋白质是两性电解质，在溶液中可解离的基团除肽链末端的α—氨基和α—羧基外，还有很多侧链基团在一定的pH条件下能解离而使蛋白质带电。其电泳的方向和速度主要决定于所带电荷的性质，以及所带电荷数量、颗粒大小和形状。不同的带电颗粒在同一电场中泳动速度不同，常用迁移率来表示。迁移率的定义是指带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。 Click to add Text Click to add Text Click to add Text Click to add Text Click to add Text Click to add Text Click to add Text Click to add Text Click to add Text 当溶液的pHpI（等电点）时，蛋白质带负电荷，在电场中向正极移动，而的pHpI时，则带正电荷，电泳时向负极移动。 根据这个原理，就可以从蛋白质混合物中将各种蛋白质分离出来。因此，电泳技术在生物化学与分子生物学研究中被广泛用于生物大分子或小分子（如蛋白质、核酸、氨基酸等）的分离纯化与分析鉴定等。同时此项技术也普遍用于临床诊断和工农业生产实践中，并已发展成为这些部门的重要分析分离手段。 醋酸纤维素薄膜电泳是以醋酸纤维素薄膜为支持物的一种区带电泳。这种薄膜具有均一的泡沫状结构，厚度为120μm，渗透性强，对样品无吸附作用，用它作支持物进行电泳，电泳效果比纸电泳好，具有样品用量少，分离速度快，电泳图谱更为清晰，灵敏度也较高（5μg / ml以上）等优点。目前已广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、脂蛋白、同工酶的分离和测定等方面。 血清中含有清蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、分子量、等电点及形状不同（如图2-1），在电场中迁移速度不同。分子量小、等电点低、在相同碱性pH缓冲体系中、带负电荷多的蛋白质颗粒在电场中迁移速度快。例如，正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳1h左右，染色后可显示5条区带。清蛋白泳动最快，其余依次为α1，α2，β-及γ-球蛋白（如图）。这些区带经洗脱后可用分光光度法定量，也可直接进行光吸收扫描自动绘出区带吸收峰及相对百分比。临床医学常利用它们间相对百分比的改变或异常区带的出现作为临床鉴别诊断的依据。 156000-300000 6.85-7.85 γ-球蛋白 5 90000-150000 5.12 β-球蛋白 4 300000 5.08 α2-球蛋白 3 200000 5.08 α1-球蛋白 2 69000 4.88 清蛋白 1 分子量 等电点（pI） 蛋白质名称 序号 + - 1 2 3 4 5 6 正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图 6为点样原点 （一）浸 泡 用镊子夹取醋酸纤维薄膜放入缓冲液中浸泡20min。 若漂浮于液面的薄膜在15—30s内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳；若薄膜润湿缓慢，色泽深浅不一或有条纹及斑点等，则表示薄膜不均匀应弃去，以免影响电泳结果。 （二） 点 样 把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗滤纸内吸干多余的水分，然后平铺于玻璃板上（无光泽面朝上）。将点样器先放在血清中沾一下，再在膜条一端2-3cm处轻轻垂直水平落下并立即提起，这样即在膜条上点了细条状的血清样品。 ＋ 此步是实验的关键，点样前应在滤纸上反复练习，掌握点样技术后再正式点样。 （三）电 泳 将膜条平悬于电泳槽支架的滤纸桥上，膜条上点样一端靠近负极。盖严电泳室，通电，调节电压160伏，电流强度0.4—0.7mA/cm膜条，时间为90min 。 要使两个电极槽内的缓冲液彼此处于同一水平状态 Text in here Text in here Text i