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实训一 光学显微镜的使用和革兰氏染色 一、目的要求 1．学习普通光学显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。 2．学习并掌握油镜的原理和使用方法。 3．掌握微生物涂片技术。 4．掌握革兰氏染色法。 二、器材 1.菌种：啤酒酵母、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌约24h营养琼脂斜 面培养物。 2.溶液或试剂：革兰氏染色液、香柏油、二甲苯 3.仪器或其他用具：显微镜、擦镜纸、酒精灯、载玻片、接种环等 三、实验操作步骤 （一）显微镜操作 1、光学显微镜的结构 结构：机械系统 光学系统： 反光镜：向内移，光线减弱，向外移，光线加强 虹彩光圈：向左关闭，向右开启，并增强光线。 聚光器：向上光线增强，向下减弱 2、显微镜的使用方法 用光学显微镜观察微生物形态时，一般遵循先低倍镜观察，后高倍 镜观察，再油镜观察。 1）低倍镜操作方法 斜面注视，将载物台上升至距接物镜0.5cm处--左眼注视，用粗调 焦螺旋缓慢下降载物台（或上升接物镜）--直至出现物象为止?再 用微调焦螺旋调至清晰 2）高倍镜操作方法 将低倍镜观察到的目标移动至视野中央--将低倍镜镜头转换成高倍 镜镜头--用微调焦螺旋调至清晰。 注意：高倍镜观察时，光线需增强。 3）油镜的操作方法 将高倍镜观察到的目标移动至视野中央?将高倍镜镜头挪开，于载 玻片上滴一滴石蜡油?将油镜镜头移动至视野中央，让油镜镜头浸 入石蜡油（至油晕不再扩大为止）?用微调焦螺旋调节至清晰 注意：油镜的操作需要较强的光线，故需将光线调至最强。 油镜用后处理： 第一遍：用擦镜纸拭去镜头上的镜油 第二遍：用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去头上残 留的油迹 第三遍：再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。 （二）革兰氏染色 1、涂片 取两块载玻片，各滴加一小滴无菌的生理盐水（或蒸馏 水）于玻片中央，用接种环以无菌操作从大肠杆菌斜面上挑 取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。同样方法从蜡样芽 孢杆菌或枯草芽孢杆菌的斜面上挑取少许菌苔涂片于另一块 载玻片上。 注意：载玻片要洁净无油迹； 滴生理盐水和取菌不宜过多； 涂片要涂抹均匀，不宜过厚； 切忌用手或其他纸擦拭镜头，以免使镜头沾上污渍或产生 划痕，影响观察。 2.干燥 室温自然干燥。 3.固定 涂面朝上，在火焰上过2～3次。 目的：是使细胞质凝固，以固定细胞形态， 并使之牢固附着在载玻片上。 4.初染 滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色1~2分钟， 水洗。 5.媒染 用革兰氏碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1分钟，水洗。 6.脱色 用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下， 用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色，立即 水洗。 7.复染 用番红染液复染约2分钟，水洗。 8.镜检 先低倍镜观察，后高倍镜观察，再油镜观察。 3. 脱色—95%乙醇溶液进行颜色洗脱 细菌呈现第一次染色的效果紫色，革兰氏阳性菌（紫阳G+）； 呈现第二次染色的效果红色；称革兰氏阴性菌（红阴G -） 四、思考题 1、用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间加滴什么油？起什么作用？ 2、试列表比较低倍镜、高倍镜及油镜各方面的差异。为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作？ 3、你认为哪些因素会影响革兰氏染色结果的正 确性？其中最关键的环节是什么？ 4、涂片后为什么要进行固定？固定时应注意什么？ 实训二 培养基的配置及玻璃器皿的包扎 一、目的 1、掌握培养基的制备方法。 2、掌握高压蒸气灭菌技术。 3、熟悉玻璃器皿的包扎方法。 4、掌握干热灭菌法灭菌技术。 二、仪器和材料 1、溶液或试剂 10%HCl、10%NaOH、牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水、 可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、 KNO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O。 2、仪器或其他用具 pH试纸、培养基分装器、高压蒸气灭菌锅、玻璃棒、天平、牛角 匙、记号笔。试管、移液管、锥形瓶、烧杯、量简纱布、棉花、牛皮纸（或报纸）、电烤 箱。 三、方法与步骤 （一）培养基的配置 1、牛肉膏蛋白胨培养基的配制 其配方法如下：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂 15~20g，水1000mL，pH7.4~7.6。 （1）