鹿卵母细胞体外培养与体外受精的超微结构研究.pdfVIP

鹿卵母细胞体外培养与体外受精的超微结构研究 齐艳萍 李和平* 崔 凯 （东北林业大学野生动物资源学院，哈尔滨150040 ） Study on the Ultrastructure of Wapiti (Cervus elaphus) Oocytes in Vitro Cultivation and Fertilization QI Yan-Ping LI He-Ping* CUI Kai （College of Wildlife Resources, Northeast Forestry University Harbin 150040 ） 摘要：用 FSH 对鹿进行超数排卵，用抽吸法和切割法采集卵泡卵母细胞进行体外培养和体外 受精，利用透射电镜观察不同时期鹿卵母细胞的超微结构，旨在揭示鹿卵母细胞体外培养前、 培养后及受精后超微结构的变化规律。结果表明，培养前卵丘细胞紧紧包围卵母细胞，卵母 细胞表面的微绒毛细长，伸入透明带内，皮质区及细胞中心分布大量的细胞器。培养后卵丘 细胞与卵母细胞结合松散，卵母细胞表面微绒毛短粗，倒伏于卵表面，第一极体无核，皮质 颗粒在皮质区成层排列，细胞质中细胞器分布均匀。受精后卵母细胞表面的微绒毛由倒伏而 竖起，第二极体有核，细胞质中细胞器丰富，主要分布于细胞中心。鹿卵母细胞外的卵丘细 胞由紧密包裹到结合松散或脱落；微绒毛由细长到短粗，由倒伏而竖起；细胞器由近核区迁 移到质膜下，而后分散在细胞质中。 关键词：鹿；卵母细胞；体外培养；体外受精；超微结构； 鹿是经济价值和观赏娱乐价值都很高的草食动物，在分类上属于哺乳纲偶蹄目鹿科的反 刍动物。体外受精技术是哺乳动物胚胎生产的有效途径之一，但在鹿类动物中其研究正处于 起步阶段。通过对鹿卵母细胞超微结构进行研究，可以获得许多形态学资料，为体外受精技 术的研究提供依据。目前，对鹿卵母细胞超微结构的研究尚属空白。本研究旨在揭示鹿卵母 细胞体外培养前、培养后及受精后超微结构的变化规律。 1 材料与方法 1.1 卵母细胞的采集 将繁殖季节的健康成年母马鹿使用FSH 进行超排处理后，用常规外科手术法采得卵巢。 将卵巢放入盛有 37℃灭菌生理盐水的保温瓶中，2 小时内带回实验室，用37℃灭菌生理盐 水充分冲洗卵巢组织后，用注射针头抽吸卵泡卵母细胞，然后再用刀片纵横切割卵巢，收集 卵巢内卵泡卵母细胞，在实体显微镜下挑选形态完整、胞质均匀的卵丘卵母细胞复合体。 1.2 精子的来源与获能 马鹿细管冷冻精液购自黑龙江农恳科学院哈尔滨特产研究所种鹿场，每管冻精容量为 0.5 毫升。将细管冻精投入37～38℃温水中解冻，用BO 受精液进行体外获能，将获能后的 精子用于卵母细胞的体外受精试验。 1.3 卵母细胞的体外培养与受精 将收集的卵丘卵母细胞复合体用以M199 为基础的培养液中进行成熟培养，待卵母细胞 成熟后移入用BO 液配制的受精液中进行体外受精。体外培养与受精的条件均为5 ％CO2 、 38℃和饱和湿度，在SANYO MCO-15AC 型CO2 培养箱中进行。 1.4 透射电镜样品的制作 分别取培养前、培养后和受精后的卵母细胞经PBS 缓冲液（pH=7.2 ）洗涤后用2.5 ％的 戊二醛和2 ％的锇酸进行双重固定（在前固定和后固定之间用PBS 冲洗），固定后用PBS 冲 洗3 次，再用乙醇 （30%、50 ％、70 ％、80％、90 ％、100％）逐级脱水，最后用丙酮置换 和Epon812 包埋剂包埋，用LKB 超薄切片机制作超薄切片。切片用醋酸双氧铀和柠檬酸铅 染色后，用JEM-1200 透射电镜观察和拍照。 2 结果 2.1 培养前的卵母细胞 卵丘细胞紧紧包围卵母细胞，其表面伸出许多突起穿过透明带到达卵母细胞表面，卵丘 细胞之间也有微绒毛；卵丘细胞质不均匀，含有丰富的线粒体、粗面内质网及大小不等的空 泡；卵丘细胞核呈卵圆形，染色质贴近核膜处呈块状分布（见图 1）。透明带均匀，与卵母 细胞结合紧密；卵母细胞表面的微绒毛伸入透明带内，微绒毛细长，数量多；卵母细胞的皮 质区含有大量的线粒体及空泡（见图 2 ）。亚皮质区除粗面内质网外无其它细胞器分布，在 内质网中散在着少量的皮质颗粒（见图 3 ）。在卵母细胞的中心及细胞核外缘有丰富的线粒 体、空泡和脂滴。线粒体呈圆形，是典型的多嵴型，体积小，数量