利用DHPLC筛查方法研究DNA的过度甲基化.docVIP

利用DHPLC筛查技术发现DNA高甲基化 关键词 甲基化 变性高效液相色谱 前列腺癌 摘要 启动子的高甲基化被认为是人类癌症的标志，同时也是导致基因失活的常见机制。因此，在过去的二十年中，发展出了许多新的技术来寻找新的甲基化靶点以及解释复杂的表观遗传机制。然而受限于寡核苷酸杂交序列或者酶解位点等原因，许多方法比较费时费力，或提供的信息有限，不能够应用于大量序列或样本的检测。本文提供了一种利用变性高效液相色谱（DHPLC）技术来筛查甲基化的方法，这种方法基于基因组DNA的亚硫酸氢盐修饰。我们使用GSTP1这种已知的前列腺癌甲基化基因来进行DHPLC作为甲基化筛查工具的方法学验证。我们利用DHPLC方法对LGALS3和SMAD4两个基因的甲基化进行了筛查。结果发现，DHPLC可以作为一种快速、敏感、高通量及经济的方法来对新靶点或DNA样本进行DNA甲基化的筛查。 简介 近来在基因组学及生物技术领域所取得的成就极大地增加了与人类癌症研究相关的分子信息的数量及可实现性。已经发现了大量的基因表达的改变，这些结果指向了一个广泛的、复杂的分子变化的网络。揭示这些基因的表达是如何改变的对于我们了解癌症的发展十分重要，并且能够帮助我们识别分子生物学标记物及新的化学预防及治疗的靶点。表观遗传学修饰——如启动子的高甲基化——正在成为如肿瘤抑制因子及在癌症发生过程中发挥重要作用的调控基因等多种基因无法表达的重要机制。1 通过对前列腺癌中已知的由于CpG岛的存在而导致下调的超过800种的基因进行筛查，我们发展了一种芯片技术对前列腺癌中启动子高甲基化的潜在靶点进行识别。用这种方法识别的新靶点中的大部分都具有大而多的CpG岛，我们希望能够建立一种对于这些靶点的甲基化程度进行快速筛查的技术。 目前检测启动子高甲基化的方法在很大程度上依赖于对基因组DNA的亚硫酸氢盐修饰，通过修饰可以将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则不被改变。2 亚硫酸氢盐处理后测序、MSP和COBRA等现有的方法对于精确的甲基化研究具有巨大的价值，但是它们对于甲基化筛查来说却有明显的局限性，因为它们或是耗费大量的时间在亚硫酸氢盐处理后测序上，或者只能对CpG岛中很小的区域进行检测（MSP和COBRA）。很明显，我们需要一种快速全面地检测新靶点甲基化的替代方法，尤其是对于那些含有大的CpG岛的基因启动子和比较大的调控区域的基因启动子。 为了达到以上目的，我们采用了变性高效液相色谱（DHPLC）方法。DHPLC方法是基于突变型和野生型序列变性温度不同的原理来工作的，目前已经被普遍应用于单个碱基替换、短片段插入和缺失的自动检测。3，4 DHPLC进行甲基化筛选的原理不同于传统DHPLC过程，而是对靶序列亚硫酸氢盐处理后产生的“多重突变”进行检测。这种从胞嘧啶向尿嘧啶的转变导致了甲基化和未甲基化的扩增序列变性温度的剧烈变化，从而造成部分变性条件下色谱柱保留时间时间（column?retention times）的改变（图1）。 我们考察了DHPLC是否能够适用于对经过亚硫酸氢盐修饰处理和无差别PCR扩增的异源前列腺癌样本中潜在靶点的DNA高甲基化进行筛查。利用这种方法，我们对前列腺癌中已知的、可能是启动子高甲基化潜在靶点的两个基因进行了筛查，对它们含有CpG岛的约1kb的序列的甲基化程度进行了检测。 图1 利用DHPLC进行甲基化分析。一个特定的DNA序列的两个等位基因可以同时是甲基化的或非甲基化的（如图中i和ii），也可能只有一个拷贝被甲基化（图中iii）。在将DNA或PCR扩增产物进行亚硫酸氢盐处理以后，其CpG岛的内容反映了扩增产物的甲基化水平。对于相同的序列来说，甲基化的模板与未甲基化的模板相比具有更高的GC并因此具有更高的融解温度。这意味着，在部分变性温度下，甲基化序列的保留时间要长于未甲基化的序列。因此，一个序列的甲基化含量可以从它的DHPLC色谱图中读出。纯合的甲基化序列在特定时间被洗脱（i），它要晚于纯合的未甲基化序列（ii）。而由于部分甲基化的产物同时含有甲基化的和未甲基化的DNA，因此可以在这两个时间点被洗脱（iii）。 perative Human Tissue Network，/）。十四份快速冰冻样品（手术后30分钟内获得的）及九份混有福尔马林的石蜡包埋（FFPE）的样品来自于前列腺切除手术患者。FFPE样品使用二甲苯脱蜡并用梯度乙醇（100%，95%，70%）再水化。组织切片中的DNA使用QIAamp DNA微量提取试剂盒（Qiagen，Valencia，CA）按说明书上步骤提取。 LNCap雄激素依赖性前列腺癌上皮细胞系、DU145及PC-3雄激素依赖性前列腺癌上皮细胞系、PZ-HPV7正常前列腺上皮细胞系及PRC30前列腺基质细胞系来自于美国标准生