乳酸对LPS诱导的MIMVEC细胞NF-κB活性的调控作用-任晓明.docVIP

乳酸对LPS诱导的MIMVEC 细胞信号通路NF-κB的调控作用 刘静，薛九州，朱志宁，任晓明 （北京农学院动物科学技术学院，北京 102206） 摘要：【目的】探讨乳酸抑制脂多糖（LPS）致大鼠肠粘膜微血管内皮细胞（MIMVEC）中核因子κB（NF-κB）P65表达的作用。【方法】原代培养MIMVEC，分为空白对照组、LPS阳性对照组、乳酸高浓度组、中浓度组和低浓度组，高、中、低浓度的乳酸预处理细胞3 h后，LPS处理细胞4 h, 用ELISA方法检测TNF-α和IL-6的表达量。用荧光定量PCR方法对NF-κB mRNA进行定量检测；用Western blotting的方法检测NF-κB p65蛋白表达的变化。【结果】荧光定量PCR结果显示，LPS处理细胞4 h的乳酸高、中、低浓度组中NF-κB mRNA的表达量是空白组对照的1.51倍、2.62倍、3.00倍，而LPS组中NF-κB mRNA的表达量是空白对照组的7.36倍；Western blotting的结果显示，各组蛋白提取物中均存在分子量约为65kd的、与兔抗NF-κB P65多克隆抗体发生免疫阳性反应的蛋白条带，且乳酸高浓度组细胞中NF-κB P65的表达与空白对照组相比差异不显著（P＞0.05）；中浓度组和低浓度组细胞中NF-κB P65的表达与空白对照组相比差异显著（P＜0.05）。LPS组NF-κB P65的表达与其他各组相比均差异极显著（P＜0.01）。【结论】乳酸对LPS所致的MIMVEC细胞NF-κB激活具有明显的抑制作用，下调了转录因子NF-κB的转录活性，进而抑制了炎性因子TNF-α和IL-6的表达。 关键词：乳酸；肠黏膜微血管内皮细胞 ；LPS；NF-κB 脂多糖（LPS）作为内毒素的主要成分，诱导血管内皮细胞产生白细胞介素(IL)-6和肿瘤坏死因子（TNF）-α，这些因子是参与内毒素所致休克、全身炎症反应综合征等的重要炎性介质[1-3]。抑制这些因子的合成，便可抑制NF-κB细胞信号转导通路的激活。为深入探讨益生菌代谢产物乳酸抑制LPS激活NF-κB细胞信号转导通路的作用，本实验测定了不同条件下NF-κB p65亚基mRNA和蛋白的表达情况。 1 材料与方法 1.1 试验动物与试验设计 将原代培养的大鼠肠粘膜微血管内皮细胞（MIMVEC）分为空白对照组（A组）、LPS对照组（B组）及2.5（C组）、5.0（D组）、7.5（E组）μL/mL乳酸处理组5组。A组：加维持培养液；B组：加入1μg/mL的LPS ；C组：终浓度2.5μL/mL的乳酸预处理3h后，加入1μg/mL的LPS；D组：终浓度5.0μg/mL的乳酸预处理3h后，加入1μg/mL的LPS；E组：终浓度7.5μL/mL乳酸预处理3h后，加入1μg/mL的LPS；于培养开始后第4小时裂解细胞。 1.2 主要试剂和仪器 DMEM培养基：Gibco公司产品；Hank’s干粉：Sigma公司产品；克隆专用胎牛血清、Ⅱ型胶原酶：PAA Laboratories GmbH公司产品；TNF-α、IL-6ELISA试剂盒：上海森雄科技实业有限公司产品；兔NF-κB p65亚基多克隆抗体：英国abcam公司产品；HRP标记的羊抗兔IgG：武汉博士德公司产品；TRIZOL通用型RNA快速提取试剂盒：inventrogen公司产品；20×EvaGreen：美国Biotium公司产品；荧光PCR仪、SDS凝胶电泳仪、电转仪均为美国Bio-Rad公司产品。 1.3 试验方法 1.3.1 MIMVEC原代培养 取出生24 h之内的SD大鼠乳鼠空肠，Hank’s液冲洗，纵向切开，冲洗干净内容物，剪成小段，用1 g/LⅡ型胶原酶消化，暴露出微血管网，离心，取沉淀剪成碎块，接于6孔细胞培养板中，每孔加2mL完全培养基，置于5%CO2、37℃培养箱中培养，2～3天换液1次。细胞生长至80%融合时传代。完全培养基：在基础培养基中按比例加入以下辅助成分：15％优质胎牛血清(FBS，Hyclone)、0．584 g／L谷氨酰胺、1×105 IU／L注射用青霉素(华北制药股份有限公司)、0．1 g／L RNase Inhibitor, 4μl;DNase,I buffer，10μl；DNase l, 10μl;加DEPC处理水至100μl；混匀，37℃,90min。RNA样品经1%的琼脂糖凝胶电泳验证可见28S和18S两条明亮条带，无DNA条带污染。RNA反转录为cDNA，按照以下反应体系进行：模板（RNA）3μg；引物（50μM）T18,4.0μl；DEPC处理水至25μl，混匀，70℃5min，立即冰浴；5×buffer，8.0μl；dNTP（10mM）,4.0μl;RNase Inhibitor,1.0μl