重组人细胞色素P4502C9在毕赤酵母中的胞内表达.pdfVIP

第32卷第2期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 中南民族大学学报(自然科学版)　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 Vol.32 No.2 2013年6月　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 Journal of South-Central University for Nationalities(Nat.Sci.Edition)　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 Jun.2013 重组人细胞色素P4502C9在毕赤酵母中的胞内表达 吴云华,孙鹏宇 (中南民族大学 生命科学学院,国家民委生物技术重点实验室,武汉430074) 摘　 要　 以含有CYP2C9基因完全编码框的克隆载体质粒 DNA 为模板,并在人细胞色素P4502C9 的5′端插入 × kozak序列及3′端6 His标签进行PCR扩增,克隆至真核表达载体pPIC3.5K,利用电激法将经Sal I线性化的重组 质粒pPIC3.5K-2C9 转化至毕赤酵母 GS115 中,通过抗性、表型和PCR筛选多拷贝整合株,甲醇诱导毕赤酵母 GS115/ pPIC3.5K-2C9 的表达,SDS和Western blotting分析鉴定表达产物. 结果表明:含有重组质粒的重组 pPIC3.5K-2C9表达了大小为55KD 的目的蛋白,与预期大小相符,说明人细胞色素 CYP2C9 可在毕赤酵母的 胞内表达. 关键词　 人细胞色素P4502C9;毕赤酵母;胞内表达 中图分类号　 TQ464.7;Q78　 文献标识码　 A　 文章编号　 1672-4321(2013)02-0041-05 Intracellular Expression of Human Cytochrome P4502C9inPichiapastoris Wu Yunhua,Sun Pengyu (Key Laboratory for Biotechnology of National Commission for Nationalities,College of Life Science, South-Central University for Nationalities,Wuhan430074,China) Abstract　 Using cloning vector plasmid DNA containing CYP2C9 complete gene coding frame as a template,the coding × region of human cytochromeP4502C9 with addition of kozak sequence in5′-end and6 His in3′-endwas cloned into the expression vector pPIC3.5K. The recombinant plasmidpPIC3.5K-2C9 waslinearizedbySal I andtransformed intoPichia pastoris GS115 by electroporation. The insert clonescontaining multiple copieswere selectedwith geneticin,phenotype and PCR. The expressionofPichiapastoris GS115/ pPIC3.5K-2C9wasinducedwithmethanolandanalyzedby SDSand Western blotting. The results indicated that the recombinant containing recombinant plasmid pPIC3.5K-2C9 expressed an Mw55KD protein,con