D甘露糖异构酶在大肠杆菌中的表达及 催化条件的研究.pdfVIP

第 ３８卷 第 １期 北京化工大学学报（自然科学版） Ｖｏｌ．３８，Ｎｏ．１ ２０１１年 ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｅｉｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ） ２０１１ Ｄ甘露糖异构酶在大肠杆菌中的表达及 催化条件的研究 １ ２ １ １ 刘　琦 　李　强 　袁其朋 　冯　嵬 （１北京化工大学 生命科学与技术学院，北京　１０００２９；２清华大学 化学工程系，北京　１０００８４） 摘　要：根据已知的放射性土壤杆菌体内的Ｄ甘露糖异构酶（Ｆｍｉ）氨基酸序列，设计适合在大肠杆菌内表达的 Ｆｍｉ基因序列（１２４５ｂｐ），采用体外基因拼接合成。构建了表达 Ｆｍｉ的重组大肠杆菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ３０Ｆｍｉ，诱导 表达的Ｆｍｉ蛋白经 ＳＤＳＰＡＧＥ验证为可溶性蛋白，分子量４４０００。通过实验优化了Ｆｍｉ的催化条件，结果表明 Ｆｍｉ 催化的最适 ｐＨ值为７５，最适温度为４５℃，催化 １ｈ酶活达５２９Ｕ／ｍＬ。以２５％的果糖溶液为底物时，催化 ２ｈ果 糖转化率达２９４％。 关键词：Ｄ甘露糖；Ｄ甘露糖异构酶；基因拼接；表达载体 中图分类号：Ｑ７８６ 泰威克生物技术有限公司；宿主大肠杆菌 ＴＯＰ１０感 引　言 受态，大肠杆菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）感受态，盖宁公司。 Ｄ甘露糖异构酶（ＥＣ５３１７）可催化 Ｄ甘露 １２　工具酶和试剂 糖可逆性转变成Ｄ果糖，Ｄ甘露糖是许多多糖和糖 工具酶，ＴａＫａＲａ公司；各种试剂盒，天根生化科 蛋白的组成成分，常用于合成药物，同时能作为添加 技（北京）有限公司；酵母提取物、大豆蛋白胨，Ｏｘｏｉｄ 剂有效地抑制肠内沙门氏菌的增殖。目前市场对 公司；色谱纯乙腈，Ｍｅｒｃｈ公司；其他化学试剂均为 Ｄ甘露糖的需求日益增多，采用化学法制备 Ｄ甘露 国产或进口分析纯。 ［１］ 糖因成本太高而限制了其大规模的商业化生产 。 １３　基因拼接构建目的序列 因此，用 Ｄ甘露糖异构酶将 Ｄ果糖转化为昂贵的 根据已知的放射性土壤杆菌 Ｍ３６（ＦＥＲＭＰ Ｄ甘露糖可以大大减少生产成本，具有应用前景和 １７３７７）内的Ｄ甘露糖异构酶氨基酸序列［６］，用在线 市场潜力。 引物设计软件 ＤＮＡＷｏｒｋｓ（ｈｔｔｐ： ｈｅｌｉｘｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ ∥ 目前，关于Ｄ甘露糖异构酶的研究多见于国外 ｄｎａｗｏｒｋｓ／）设计适合在大肠杆菌内表达的甘露糖异 的报道［２－４］，大多利用野生菌株直接进行发酵来生 构酶（Ｆｍｉ）基因序列，片段全长 １２４５ｂｐ。设计的 ［５］ 产Ｄ甘露糖异构酶。本文利用基因拼接技术 ，得 Ｆｍｉ基因拼接引物共３６条，其中相邻的２条寡核苷 到表达Ｄ甘露糖异构酶的目的基因，并构建了Ｄ甘 酸有 １６ｂｐ相互互补，上下游引物末端分别加上 Ｎｄｅ 露糖异构酶的诱导表达载体，转入大肠杆菌内表达， ［７］ Ｉ和ＳａｃＩ酶切位点用于后续亚克隆。参考 Ｘｉｏｎｇ 摸索其最优催化条件