梨NAC结构域蛋白基因克隆与mRNA嫁接传递性研究.pdfVIP

中国农业科学 2010,43(11):2307-2314 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2010.11.014 梨NAC结构域蛋白基因克隆与mRNA嫁接传递性研究 宫 磊，张文娜，徐海燕，杨玉艳，胡建芳，李天忠 （中国农业大学农学与生物技术学院果树细胞与分子育种实验室，北京 100193 ） 摘要：【目的】克隆梨 NAC 结构域蛋白基因 NACP，验证其 mRNA 是否可以通过韧皮部进行嫁接传递。【方法】 利用同源克隆的方法，分别克隆‘鸭梨’（ Pyrus bretschneideri Yali)和杜梨（Pyrus betulaefolia Bunge）的 NACP基因，利用生物信息学方法进行序列分析。以‘鸭梨’为接穗，杜梨为砧木进行微嫁接。从接穗茎尖、叶片、 茎段韧皮部，嫁接口及砧木韧皮部、木质部组织中提取RNA，进行RT-PCR扩增。用特异的限制性内切酶 ScrFⅠ对 其扩增产物进行酶切鉴定。利用原位杂交技术，检测 NACP 基因在植物体内的表达部位。【结果】获得‘鸭梨’和 杜梨 NACP 基因全长序列，长度均为 1 377 bp，编码 350 个氨基酸，包含两个内含子，大小分别为 111、96 bp， 分别命名为YL-NACP和DL-NACP。酶切鉴定结果表明，在接穗‘鸭梨’茎尖、叶片、茎段韧皮部中都有砧木DL-NACP 基因的 mRNA 表达，同时砧木杜梨韧皮部中也有接穗 YL-NACP 基因的 mRNA 表达，而木质部中则没有发现该基因表 达。通过原位杂交进一步证明，NACP基因只定位于韧皮部。【结论】成功地从‘鸭梨’和杜梨中克隆了全长的NAC 结构域蛋白基因NACP，并进一步证明了梨内源性的NACP 基因 mRNA可以通过韧皮部进行传递，该结果为进一步研 究果树砧木与接穗的互作机制奠定了基础。 关键词：梨；NACP基因；mRNA；嫁接；分子传递 Molecular Cloning of the NAC Domain Protein of Pear and Research on Its mRNA Transport in Phloem GONG Lei, ZHANG Wen-na, XU Hai-yan, YANG Yu-yan, HU Jian-fang, LI Tian-zhong (Laboratory of Fruit Cell and Molecular Breeding, College of Agriculture and Biotechnology, China Agricultural University, Beijing 100193) Abstract: 【Objective 】 The aim of this research is to clone the full-length DNA sequences encoding NAC domain protein in pear, and to find out whether the long-distance movement of the NACP mRNA via the phloem. 【Method 】 The full-length sequences encoding NAC domain protein were isolated from Pyrus bretschneideri Yali and Pyrus betulaefolia Bunge by the homology cloning method. Bioinformatics methods were used for sequence analysis. Heterograft experiments w