不同细胞破碎方法对无细胞蛋白表达系统细胞抽提物活性的影响.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１，３１（１）：４６５０ ? 不同细胞破碎方法对无细胞蛋白表达 系统细胞抽提物活性的影响 １，２ ３ １，２ ３ 王　雪 　权春善 　王建华 　范圣第 （１中国科学院大连化学物理研究所　大连　１１６０２３　２中国科学院研究生院　北京　１０００４９） （３大连民族学院生物化学工程国家民委教育部重点实验室　大连　１１６６００） 摘要　无细胞蛋白表达系统由于能够有效表达膜蛋白等有毒性蛋白，因此近二十年受到了关注， 其蛋白表达产率有了显著的提高。细胞抽提物活性的高低是无细胞蛋白表达系统高效运行的关 键，若找到简单易行的活性评估方法，将大大降低成本及时间。葡萄糖６磷酸脱氢酶 （ｇｌｕｃｏｓｅ６ ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，Ｇ６ＰＤＨ）是糖代谢的戊糖磷酸途径中的关键调控酶，该酶可以被用来 评估细胞抽提物的活性。以Ｇ６ＰＤＨ的活性为指标对无细胞蛋白表达系统中的抽提物活性进行 评价，并利用Ｇ６ＰＤＨ活性评价体系对机械破碎、高压破碎以及超声破碎三种破碎方法进行了比 较，得出了三种破碎方法的最佳破碎条件。机械破碎最佳破碎条件是５０００ｒ／ｍｉｎ，用直径０．１ｍｍ 玻璃珠，破碎６次；高压破碎的最佳破碎压力为１３００ｂａｒ；超声破碎最佳破碎条件是功率强度为总 功率的６０％，破碎３０次。酶活性测定结果显示机械破碎和超声破碎得到的抽提物活性比高压破 碎得到的抽提物活性略高。 关键词　无细胞蛋白表达系统　Ｇ６ＰＤＨ　破碎方法　抽提物活性 中图分类号　Ｑ８１６ 　　无细胞蛋白表达系统是一种以外源ｍＲＮＡ或ＤＮＡ 选，等等。 为模板，在细胞抽提物的酶系中补充底物，能量以及其 　　正是由于无细胞蛋白合成系统具有体内表达无可 它辅助因子来合成蛋白质的体外蛋白表达系统。早在 比拟的优点，在近二十年来，无细胞蛋白合成技术发展 ［１］ ２０世纪６０年代，Ｎｉｒｅｎｂｅｒｇ等 就利用大肠杆菌无细胞 的非常迅速。通常细胞抽提物的制备步骤包括多次的 系统来分析遗传密码，研究 ｍＲＮＡ是如何翻译成有活 离心及透析等步骤［２］，耗时较长，因此能否制备高质量 性的蛋白质。随着基因组学、蛋白质组学以及代谢组 的细胞抽提物成为制约无细胞表达能否顺利进行的关 学时代的到来，无细胞蛋白表达系统凭借其优点在近 ［３］ 键因素。Ｊａｍｅｓ等 考察了离心及透析次数对细胞抽 二十年受到了研究者的广泛关注。与传统的活体表达 提物的影响，结果表明经过步骤简化后得到的抽提物 蛋白相比，无细胞蛋白合成系统具有以下优点：（１）由 ［４］ 的蛋白表达产率并未受到明显影响。同时，Ｋｉｍ等 于无细胞蛋白合成系统并不是在细胞中合成蛋白，因 也对细胞抽提物的制备过程进行了优化，结果显示菌 此在表达膜蛋白以及细胞毒性蛋白方面有明显优势； 体细胞破碎后经过１２０００ｇ离心１０分钟得到的抽提物 （２）可以直接以质粒或 ＰＣＲ产物为模板来表达蛋白 同样能够满足体外蛋白表达的要求。 质；（３）无细胞蛋白合成系统还能够表达含有非天然氨 基酸的蛋白；（４）操作者可以直接对无细胞蛋白