一株产海因酶菌种的筛选与鉴定.pdfVIP

No．1 第31卷第1期 广西师范大学学报：自然科学版 V01．3I 2013年3月 of Normal ScienceEdition Mar．2013 Journal University：Natural Guangxi 一株产海因酶菌种的筛选与鉴定 王培1’2，曹建华1，宋德贵2，辜澜涛2，董研玲3 (1．中国地质科学院岩溶地质研究所国土资源部岩溶动力学重点实验室，广西桂林541004； 2．广西师范大学生命科学学院，广西桂林541004，3．武汉生物工程学院，湖北武汉430415) 摘要：通过对土壤中微生物以单一海因类似物作为唯一氮源富集、分离和纯化，利用双层琼脂法筛选获得产 海因酶菌株，以基因工程手段提取其DNA，并进行特异性的16SrDNA测序，最终利用Blastn工具将其基因 序列与GenBank数据库中的进行序列比对。研究表明：该菌与BacillusQM megateHum B1551(NC一004604) 序列相似性达到98％，证明该菌为巨大芽孢杆菌。 关键词：海因酶；双层琼脂法；16SrDNA}巨大芽孢杆菌 中图分类号：Q93—331 文献标识码：A 文章编号：1001—6600(2013)01—0119—06 近几年国际市场对光学纯的氨基酸，如D一苯甘氨酸、D一苯丙氨酸、D一对羟苯甘氨酸的需求量大增，因 为它们可作为合成p内酰胺类抗生素、诺卡菌素、万古霉素等抗生素的侧链组成部分和农药的前体[1’2]。其 中p内酰胺类抗生素抗菌能力强，抗菌谱广，成为国内最紧缺的医药中间体之一[34]。 氨基甲酰氨基酸，后者在N一氨甲酰水解酶的作用下可以生成光学纯的氨基酸[5。]，产生D型或L型N．氨 甲酰基a一氨基酸的酶[8]。作为生产L型和D型氨基酸的关键酶，其在工业上具有广泛而重要的应用价值。 有关海因酶的报道始于20世纪30年代初，在以后的研究中人们发现不同动物的某一特定组织和植物以 及微生物中都有海因酶[9]，对其研究也不断深入。国内对海因酶的研究也多集中在对海因酶光学活性、海 因酶的提取及氨基酸生产工艺的优化等方面。董妍玲等Elo]对几种豆类来源的D一海因酶进行提取和特性 的研究，郭峰等[11]对海因酶转化体系中消旋过程进行了研究，但并未从更深一层的基因角度来对筛选获 得的产海因酶菌株进行分类学上的鉴定。近年来，随着基因工程技术的发展，特别是测序技术的进步，人们 逐渐开始关注从微生物中筛选产海因酶的菌株，并对其产海因酶基因序列进行测定，进而利用基因工程手 段构造高效产酶的野生菌来大量生产海因酶。 本文正是结合以单一海因类似物作为唯一氮源法和双层琼脂法从土壤样品中筛选出产海因酶的菌 株，利用基因工程手段获得其DNA，最终通过对其特异性的16S rDNA测序确定该海因酶产生菌种属，拟 为今后构建基因工程菌获得高效表达的重组野生菌提供实验依据。 1材料与方法 1．1菌种来源 采样区位于湖北省武汉市新洲区阳逻街武汉生物工程学院西园学生公寓旁，地理坐标：30。42’46．50” cm)，用 自封袋带回实验室低温冰箱中保存备用。 收稿日期：2012—11—19 开放课题、主任基金(KDL2012—04) ac．cn 万方数据 120 广西师范大学学报：自然科学版 第31卷 1．2培养基 富集培养基和分离培养基相关资料见文献[12—13]。 诱导培养基：