GluconobacteroxydansNH10中短链D阿拉伯糖醇脱氢酶的研究.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，３０（１１）：３９４３ ? ＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｏｘｙｄａｎｓＮＨ１０中短链 Ｄ阿拉伯糖醇脱氢酶的研究 戴小燕　沈晓波　朱宏阳　徐　虹 （南京工业大学食品与轻工学院材料化学工程国家重点实验室　南京　２１０００９） 摘要　以氧化葡萄糖酸杆菌（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｏｘｙｄａｎｓ）ＮＨ１０基因组ＤＮＡ为模板，扩增得到Ｄ阿拉 伯糖醇脱氢酶基因ａｒＤＨ，将其克隆到大肠杆菌表达载体ＪＭ１０９（ＤＥ３）中进行诱导表达。ＳＤＳ ＰＡＧＥ电泳分析ＡｒＤＨ的分子量约为３０ｋＤａ，是一个短链脱氢酶，既能催化Ｄ阿拉伯糖醇氧化为 Ｄ木酮糖，又能催化Ｄ木酮糖还原为Ｄ阿拉伯糖醇。催化氧化反应时，对Ｄ阿拉伯糖醇的Ｋ 为 ｍ ＋ ＋ ＋ ６０．６７ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｖ 为０．８０３Ｕ／ｍｇ；它能同时依赖于ＮＡＤ 和ＮＡＤＰ ，但是更加偏好辅酶ＮＡＤ ； ｍａｘ 最适ｐＨ为１２．０。还原反应对Ｄ木酮糖的 Ｋ 为３６．３９ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｖ 为１．７１Ｕ／ｍｇ；最优ｐＨ为 ｍ ｍａｘ ７．０，最适温度均为３０℃。 关键词　氧化葡萄糖酸杆菌　Ｄ阿拉伯糖醇脱氢酶　克隆 中图分类号　Ｑ８１５ 　　Ｄ阿拉伯糖醇脱氢酶（Ｄａｒａｂｉｔｏｌｄｅｈｙｄｏｇｅｎａｓｅ， 株Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓＣＧＭＣＣ１．１１０的ＡｒＤＨ基因在Ｅ．ｃｏｌｉ中 ＡｒＤＨ）是一种多元醇脱氢酶，已经报道了在Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ， 实现了克隆表达，发现ＡｒＤＨ属于短链脱氢酶家族，依 Ｃａｎｄｉｄａ，Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ等菌株 中发现 了该酶 的存 ＋ 赖于辅酶ＮＡＤＰ ，可以将Ｄ阿拉伯糖醇氧化为Ｄ木酮 ［１３］ ［４］ 在 。Ｑｕｏｎｇ等 从 Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ中纯化得到 糖，也能将Ｄ木酮糖还原为Ｄ阿拉伯糖醇。 ＡｒＤＨ，因其底物只有 Ｄ阿拉伯糖醇，从而开发出了以 　　实验室从环境中筛选得到一株Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓＮＨ１０， 该酶为关键酶的一种检测人体血液中Ｄ阿拉伯糖醇含 并利用它转化 Ｄ阿拉伯糖醇产木糖醇，随着转化的进 量的酶法，为一些由念球菌属引起的相关疾病提供了 行，底物Ｄ阿拉伯糖醇的含量会上升。一般认为，膜结 ［５］ 合的ＡｒＤＨ催化不可逆反应，因此，推测 Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ 较好的理论和技术支持。而 Ｓｈｕｎｉｃｈｉ等 报道的 Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ中的 ＡｒＤＨ却有很大的差别，他认为 ＮＨ１０可能存在另外一种特殊的ＡｒＤＨ，该酶可以将Ｄ Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ中的ＡｒＤＨ是一种膜结合上的脱氢酶，它 木酮糖还原为 Ｄ阿拉伯糖醇。模式菌株 Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ 能将Ｄ阿拉伯糖醇转化为Ｄ木酮糖，然后木糖醇脱氢 ＡＴＣＣ６２１Ｈ的基因组揭示了Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ多种膜结合脱 ［６］ 氢酶和可溶性氧化还原脱氢酶，但是却没有类似 Ｇ． 酶将Ｄ木酮糖还原为木糖醇（图１），Ａｄａｃｈｉ等 从 Ｇ． ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓＩＦＯ３２５７中分离纯化出膜结合的ＡｒＤＨ，通 ｏｘｙｄａｎｓＮＨ１０中这种特殊ＡｒＤＨ的相关报道。分析比 过研究发现它依赖于辅酶ＰＱＱ，并能将很多多元醇氧 对Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ６２１Ｈ的全基因组序列，发现存在一种假