Ang2Tie2基因的RNA干扰及其在体外抑制血管生成的作用.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，３０（４）：２０２５ ? Ａｎｇ２、Ｔｉｅ２基因的ＲＮＡ干扰及其在 体外抑制血管生成的作用 １ １ １ １ １ １ ２ 王　彪 　刘照亮 　林菊丽 　单秀英 　王美水 　张　声 　鲁开化 （１福建医科大学附属第一医院　福州　３５０００５　２第四军医大学西京医院整形外科研究所　西安　７１００４３） 摘要　目的：探讨应用ＲＮＡ干扰（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）技术沉默Ａｎｇ２、Ｔｉｅ２基因及其在体外 抑制血管生成的研究，为将来进一步进行抑制肿瘤血管生成的动物实验研究奠定基础，为肿瘤的 基因治疗提供实验依据。方法：用ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ１．０Ｕ６Ａｎｇ２／Ｔｉｅ２ｓｉＲＮＡ重组质粒转染人脐静脉内 皮细胞（ＨＵＶＥＣｓ），采用ＲＴＰＣＲ检测各组ＨＵＶＥＣｓＡｎｇ２、Ｔｉｅ２的ｍＲＮＡ表达状况。应用体外血 管生成的三维培养模型研究转染后的ＨＵＶＥＣｓ在体外形成血管样结构的情况。结果：ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ １．０Ｕ６Ａｎｇ２／Ｔｉｅ２ｓｉＲＮＡ重组质粒转染 ＨＵＶＥＣｓ后，ＲＴＰＣＲ检测结果显示：Ａｎｇ２、Ｔｉｅ２基因 ｍＲＮＡ的表达水平均受到明显抑制（Ｐ＜０．０５），并且ｓｉＲＮＡ的２条重组质粒之间均无明显差别（Ｐ ＞０．０５）。转染后的ＨＵＶＥＣｓ在体外三维培养模型中血管样结构形成的数量和长度均明显减少 （Ｐ＜０．０５），表明血管生成受到明显抑制。结论：Ａｎｇ２ｓｉＲＮＡ、Ｔｉｅ２ｓｉＲＮＡ能够抑制 ＨＵＶＥＣｓ中 Ａｎｇ２和Ｔｉｅ２的ｍＲＮＡ表达，从而在体外抑制血管生成。 关键词　ＲＮＡｉ　促血管生成素家族及其受体　血管生成　内皮细胞体外三维培养 中图分类号　Ｑ８１９ 　　 ＲＮＡｉ是 由双链 ＲＮＡ（ＤｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡ， 复合体（ＲＮＡｉｎｄｕｃｅｄｓｉｌｅｎｃｉｎｇｃｏｍｐｌｅｘ，ＲＩＳＣ）。ｓｉＲＮＡ ｄｓＲＮＡ）转化成小分子干扰ＲＮＡ（ｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ， 通过与同源ｍＲＮＡ的特异配对，引导ＲＩＳＣ特异地降解 ［１］ 同源ｍＲＮＡ，导致基因表达的抑制，因此，小片段的 ｓｉＲＮＡ）所介导的一种基因沉默的过程 ，是生物进化 ［４］ 中一种保守的防御机制。目前一般认为ＲＮＡｉ过程包 ｓｉＲＮＡ可以诱导高效的基因沉默 。由于ＲＮＡｉ能高 ［２］ 效特异地阻断基因的表达，并且具有低毒性，因而可以 括两个阶段 ，起始阶段和效应阶段，但也有不少学者 认为还应包括 ｓｉＲＮＡ扩增阶段。起始阶段：ｄｓＲＮＡ进 利用ＲＮＡｉ来阻断目的基因的表达，达到治疗疾病的目 入细胞后被一种具有Ｒｎａｓｅ 样活性的ｄｓＲＮＡ特异性 的。我们可以利用 ＤＮＡ载体———ＲＮＡｉ技术，构建重 Ⅲ 核酸内切酶（ｄｓＲＮＡｓｐｅｃｉｆｉｃｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ，Ｄｉｃｅｒ）作用 组表达质粒 ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ１．０Ｕ６Ａｎｇ２／Ｔｉｅ２ｓｉＲＮＡ抑制 ［３］ Ａｎｇ２和Ｔｉｅ２基因的表达，从而达到治疗的目的。 下识别并切割成２１～２３ｎｔ的ｓｉＲＮＡ 。ｓｉＲＮＡ正义链 与反义链各有２１个碱基，其中间的１９个碱基配对，两 　　促血管生成素（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ａｎｇ）家族是近年来新 端的３′端都有２个不配对的碱基。ｓｉＲＮＡ是 ＲＮＡｉ作 发现的一种特异性作用于血管内皮细胞的调节因子，迄 用发生的重要中间分子，其序列与所作用的靶 ｍＲＮＡ 今为止已发现的促血管生成素存在的四种形式为：Ａｎｇ１、